ניתוח של המעבר צומת הפער תלוי מירנה עם מיקרוסקופיה 3D-FRAP
Summary
כאן, אנו מתארים את היישום של התאוששות מימדי תלת מימדי לאחר photobleaching (3D-FRAP) לניתוח של צומת הפער התלוי תלוי של מירנה. בניגוד לשיטות מיושמות בדרך כלל, 3D-FRAP מאפשר כימות של העברה בין תאית של RNAs קטנים בזמן אמת, עם רזולוציה גבוהה ספטיו- temporal.
Abstract
קטן RNAs antisense, כמו מירנה ו siRNA, לשחק תפקיד חשוב בפיזיולוגיה הסלולר פתולוגיה, יתר על כן, ניתן להשתמש סוכני טיפולית לטיפול במספר מחלות. הפיתוח של אסטרטגיות חדשות וחדשניות עבור טיפול מירנה / siRNA מבוסס על ידע נרחב של המנגנונים הבסיסיים. נתונים אחרונים מראים כי RNAs קטנים מוחלפים בין התאים בצורה תלויה בצומת הפער, ובכך גורם להשפעות גנטיות של הגן בתא הנמען. טכניקות ביולוגיות מולקולריות וניתוח cytometric זרימה משמשים בדרך כלל כדי ללמוד את חילופי בין תאיים של מירנה. עם זאת, שיטות אלה אינם מספקים רזולוציה גבוהה טמפורלית, אשר הכרחי כאשר לומדים את הפער השטף פער של מולקולות. לכן, כדי לחקור את ההשפעה של מירנה / siRNA כמו מולקולות איתות בין תאיים, כלים חדשים נדרשים שיאפשר ניתוח של אלה RNAs קטנים ברמה התאית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את apPlication של התאוששות פלואורסצנטי תלת מימדי לאחר photobleaching (3D-FRAP) מיקרוסקופ כדי להבהיר את צומת הפער תלוי החליפין של מולקולות מירנה בין תאים לבביים. חשוב לציין, זה פשוט ולא פולשני לחיות הדמיה גישה הדמיה מאפשרת הדמיה וכימות של shuttling פער junctional של RNAs קטן שכותרתו fluorescently בזמן אמת, עם רזולוציה גבוהה ברזולוציה זמן. הנתונים המתקבלים על ידי 3D-FRAP מאשרים מסלול חדש של רגולציה גנים בין תאיים, כאשר RNA קטנים פועלים כמולקולות איתות בתוך הרשת הבין-תאית.
Introduction
קטנים RNAs noncoding הם שחקנים חשובים בתחום הרגולציה הגן הסלולרי. מולקולות אלה מורכבים 20-25 נוקליאוטידים כי לאגד mRNA מטרה מסוימת, המוביל לחסימה של תרגום או ל mRNA השפלה 1 , 2 . תהליך הרגולציה הגנטית שנעשה על ידי RNA קטנים, כגון מירנה ו siRNA, הוא מנגנון שמרני מאוד שנמצא במינים שונים רבים 3 . בפרט, מולקולות מירנה הם בעלי חשיבות מכרעת למגוון של תהליכים פיזיולוגיים, כולל התפשטות, דיפרנציאציה, התחדשות 4 , 5 . בנוסף, dysregulation הביטוי מירנה מיוחסת להפרעות פתולוגיות רבות. מקביל, miRNAs הוכחו להיות מתאים כמו סמנים ביולוגיים לאבחון כמו סוכני טיפולית עבור טיפול גנטי 6 , 7 </suP>.
צמתים הפער (GJs) הם מבנים חלבונים מיוחדים בקרום פלזמה של שני תאים סמוכים המאפשרים חילופי diffusional של מולקולות עם משקל מולקולרי של עד 1 kD. הם הוכחו כחשובים להתפתחות רקמות, דיפרנציאציה, מוות לתאים והפרעות פתולוגיות כגון סרטן או מחלות לב וכלי דם 8 , 9 , 10 . מספר מולקולות תוארו כמי שמסוגלות לחצות את ערוצי ה- GJ, כולל יונים, מטבוליטים ונוקליאוטידים. מעניין, GJs נמצאו גם לספק מסלול לתנועה בין תאיים של RNA קטנים 11 , 12 . לפיכך, miRNAs יכול לפעול לא רק בתוך התא שבו הם מיוצרים, אלא גם בתוך תאים הנמען. זה מדגיש את התפקיד של miRNAs במערכת interducellular transduction האות. יחד עם זאת, הנתונים להפגיןכי פער תקשורת intertellular פער קשורה קשר הדוק לתפקוד מירנה. בגלל ההשפעה המשמעותית של מירנה ו GJs על הומאוסטזיס רקמות, פתולוגיה, ואבחון, הבנה מקיפה של הפונקציה של GJs ואת הדינמיקה הבין תאיים הקשורים מירנה יעזור להבהיר את המנגנונים של מחלות מבוססות מירנה לפתח אסטרטגיות חדשות עבור טיפולים מירנה.
בהתאם להיקף של צימוד genctional הפער, העברת מולקולות מירנה בין התאים יכול להיות תהליך מהיר מאוד. לכן, מתודולוגיה המאפשרת הדמיה וכימות של תנועה בין תאנית מהירה של אלה מולקולות איתות רגולציה נדרשת. בדרך כלל, cytometry זרימה וטכניקות ביולוגיות מולקולריות יושמו כדי להדגים את shuttleling של RNAs קטנים 11 , 12 , 13 , 14 . עם זאת, בניגוד micros FRAPלהעתיק, גישות אלה חסרים ברזולוציה טמפורלית גבוהה, אשר חובה בעת ניתוח החליפין של מירנה באמצעות GJs. יתר על כן, מיקרוסקופ FRAP הוא פולשני פחות ולכן מייצג חזק ורומנטי לחיות הדמיה תא טכניקה כדי להעריך את חילופי GJ תלויי של מולקולות במספר סוגי תאים 15 , 16 , 17 .
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את היישום של 3D-FRAP להעריך מירנה shuttling בין cardiomyocytes. לשם כך, cardiomyocytes היו transfected עם מירנה שכותרתו fluorescently. תא מסומן עם miRNA זה היה photobleached, ואת הפער פער miRNA מחדש של תאים סמוכים נרשמה באופן תלוי זמן. רזולוציה גבוהה של הניסויים FRAP מציע את האפשרות לבצע מחקרים קינטיים להערכה מדויקת של העברה בין תאיים של מירנה ו siRNA בין תאים חיים. מורוVer, כמו RNAs קטן ניתן להחליף באמצעות מנגנונים שונים עם קינטיקה שונה מאוד, מיקרוסקופ FRAP יכול לעזור להבהיר את מידת ההשתתפות של GJs בתהליכים Shuttleling בהתאמה 18 . בנוסף, 3D-FRAP ניתן להשתמש כדי לחקור שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים בחדירות GJ ואת השפעתה על העברת RNA קטן 15 , 19 .
Protocol
Representative Results
Discussion
MiRNAs הם שחקני מפתח בפיזיולוגיה הסלולרית והוצגו כמולקולות איתות באמצעות שימוש – בין היתר – GJs כנתיב עבור חילופי בין תאיים 11 , 12 , 22 . הפרוטוקול הנוכחי מציג במבחנה לחיות תאים תא הדמיה טכניקה לאפיין את זה Shifting GJ תלו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך הפדרלי ומחקר גרמניה (FKZ 0312138A ו FKZ 316159), המדינה מקלנבורג-מערב פומרניה עם האיחוד האירופי מבנית קרנות (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 ו ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1), ואת הלב הגרמני קרן (F / 01/12). בנוסף, RD נתמך על ידי תוכנית FORUN של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק (889001), קרן DAMP ו- BMBF (VIP + 00240).
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA – A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
