JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

Soruşturma von Willebrand faktör patofizyolojisi kullanarak bir akışı odası Model von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumu

Published: August 14, 2017
doi:
10.3791/55917
, , , ,
1Department of Pathology and Molecular Medicine,Queen’s University, 2Department of Medicine,Queen’s University

Summary

Bu yazıda, endotel von Willebrand değerlendirmek için bir yöntem tarif faktör yayın ve sonraki trombosit yakalama inflamatuar bizi canlı tutan bir vitro akış odası sistemi kullanarak sıvı kesme oluşuyor.

Abstract

Von Willebrand faktör (VWF) trombosit adezyonu ve endotel hasarı sitelerdeki toplama aracılık eder ve bu faktör VIII dolaşımda taşıyan bir multimeric glikoprotein koagülasyon faktördür. VWF endotel hücreleri tarafından sentezlenir ve de yapısal plazma serbest bırakılır veya Weibel Palade organları (WPBs) adı verilen özel organelleri içinde yanıt Kan durdurucu sargı meydan okuma olarak isteğe bağlı yayın için depolanır. Procoagulant ve proinflamatuar uyaranlara hızla WPB ekzositozu ve VWF yayın teşvik edebilirsiniz. Endotel hücreleri tarafından yayımlanan VWF çoğunluğu plazmada dolaşır; Ancak, VWF bir kısmı endotel hücre yüzeyine demirli. Fizyolojik kesme koşullar altında endotel demirlemiş VWF nidus trombüsü oluşumu temsil edebilir bir VWF-trombosit dize oluşturan trombosit için bağlayabilirsiniz. Bir akış odası sistemi görsel olarak endotel hücreleri VWF sürümünden ve tekrarlanabilir ve VWF aracılı trombüsü oluşumu Patofizyoloji alakalı bir şekilde yakalamak sonraki trombosit gözlemlemek için kullanılabilir. Bu yöntemi kullanarak, endotel hücreleri bir akış odasında kültürlü ve daha sonra secretagogues ile WPB ekzositozu ikna etmek için teşvik vardır. Yıkanmış trombosit sonra aktive endotel üzerinde derin. Trombosit aktif hale gelir ve daha sonra sıvı akış yönü uzun VWF dizelerinde bağlayın. Hücre dışı Histon procoagulant ve proinflamatuar uyarıcı kullanarak, biz endotel hücreleri Histon tedavi tedavi edilmezse endotel hücrelere göre artan VWF-trombosit dize oluşumu gözlenen. Bu iletişim kuralı bir nicel, görsel ve gerçek zamanlı değerlendirme modelleri trombozu ve hemostaz VWF-trombosit etkileşimleri aktivasyon açıklar.

Introduction

Tromboz ölüm dünya çapında1 önde gelen nedenidir ve yanıt todysregulated trombosit aktivasyon ve Trombin nesil her iki veinsand arterler içinde gelişebilir. VWF plazma seviyeleri kan pıhtılaşması anahtar bir regülatör, mademki düzeyleri düşük (< % 50) von Willebrand hastalığı (VWD)2 ve yüksek düzeyleri olarak bilinen kanama bozukluğu sonucu (> % 150) Venöz3 riski ile ilişkili olan ve Arteryel4 tromboz.

VWF megakaryocytes ve endotel hücreleri tarafından sentezlenen ve trombosit α-granül ve WPBs, sırasıyla depolanan bir multimeric glikoprotein var. Kan durdurucu sargı meydan okuma, VWF endotel WPBs aktive endotel hücreleri5 veya maruz kollajen damar duvarı6dolaşımdaki trombositler urgan üzerinden yayınlanacak. VWF endotel hücrelere ankraj P-selektin7 ve integrin αvβ38tarafından aracılı olduğu gösterilmiştir. Trombosit α-granül mağazaları sonraki sürümü daha da trombosit-trombosit etkileşimleri trombosit tak oluşumu, koagülasyon cascade ve fibrin yayılması için gerekli iskele için stabilize etmek için yerelleştirilmiş VWF konsantrasyonları artırabilirsiniz Yeminli ifade. VWF trombosit-bağlama etkinliği tarafından multimeric yapısı, daha fazla kan durdurucu sargı aktivite9,10sahip yüksek molekül ağırlığı multimers ile düzenlenmiştir. Dolaşımda, VWF da pıhtılaşma faktör VIII bir taşıyıcı olarak davranır.

Sıvı kesme stres VWF Fizyoloji temel bir düzenleyicisidir. Yamultma stres yokluğunda, VWF küresel bir formda, trombosit glikoprotein IB yapışma11için bağlayıcı etki alanlarını gizlemek bulunmaktadır. Yamultma stres olmadığı durumlarda, bir metalloprotease, bir disintegrin ve metalloprotease ile trombospondin motifi (ADAMTS13), bölünme sitesine maruz kalmaktadır. ADAMTS13 böylece onun kan durdurucu sargı etkinlik12azaltarak multimer boyutu, düzenleyen çıplak ve trombosit dekore edilmiş VWF dizeleri cleaves.

VWF bir Akut Faz proteinidir ve hipoksi13, enfeksiyon14ve proinflamatuar sitokinler, dahil olmak üzere çok sayıda çekim gücü, VWF yayın endotel hücrelerden aracılık gösterilmiştir. Benzer diğer inflamatuar ajanlar, hücre dışı Histon da sistemik VWF sürümde fareler15,16 ve trombosit vitro17,18, aktivasyonu teşvik gösterilmiştir 19. bu lizin farklılıkları olarak Histon alt türü bağımlı olmasını gösterildi ve arginin içerik işlev15etkileyebilir. Lysine açısından zengin (HK) etkisini araştırmak için bir akış odası kurmak için çalışma hedeflerimiz model ve arginin bakımından zengin (HR) Histon alt türlerini ve endotel VWF yayın ve gerçek zamanlı trombosit secretagogues yakalama, potansiyel erken olaylarda iltihap kaynaklı kan pıhtılaşması.

Bu akış odası metodoloji subendothelial kollajen, endotel hücreleri, VWF ve trombosit arasındaki etkileşimler vivo içinde görsel, tekrarlanabilir ve ölçülebilir bir vitro sistemde beyannamedir. VWF-trombosit etkileşimleri WPB salgılanması, trombosit aktivasyon ve VWF proteolizis dahil olmak üzere, düzenleyen yolu tüm yönleriyle gerçek zamanlı değerlendirmesi için sağlar. VWF çalışmalar kontrollü kesme stres koşullarında VWF yayın ve trombosit-bağlama işlevi20, WPB Fizyoloji21ve VWF bölünme zarar VWD mutasyonlar değerlendirmek için ADAMTS135tarafından kullanılmıştır. VWF-trombosit dize oluşumu sonucu iltihabi bir uyarıcı olarak ölçmek için bu yöntemi kullanın: hücre dışı Histon.

Protocol

Bu çalışmalar araştırma Etik Kurulu, Kraliçe’nin üniversite, Kanada tarafından kabul edildi. 1. endotel hücre stimülasyon Kollajen-kat 6-iyi doku kültürü plaka. 24 s önceden, kat 6-iyi doku kültürü plaka kollajen 1 mL ile 37 ° C’de tampon (50 µg/mL sıçan kuyruk kollajen tip 1 ile 0,02 M buzul Asetik asit). Wells 2 mL, Hank’in dengeli tuz çözüm (HBSS) ile iki kez yıkayın.Not: Tabak olabilir kalay folyo sarılı ve ha…

Representative Results

Doğrudan VWF yayın endotel hücrelerden Histon etkisini değerlendirmek için için 2 h serum-Alerjik orta içeren PMA (pozitif kontrolü), UH, İK ve HK Konfluent BOECs biz maruz. Biz HK indüklenen VWF protein (VWF:Ag) işlem görmüş endotel hücreleri (şekil 1) orta logosuna 2 kat artış gösterdi. BOECs Ah ve İK ile teşvik zaman ilginçtir, orada daha az VWF:Ag orta tedavi edilmemiş durumda algılandı. Histon için doğrudan30<…

Discussion

VWF-trombosit fizyolojik alaka VWF fizyon proteaz ADAMTS13 huzurunda onların hızlı dağılması nedeniyle tartışmalı kalır dizeleri, onlar trombosit alımı VWF tarafından bir sitede bir ölçülebilir vitro model olarak hizmet Histon düzeyleri5artışlar yerelleştirilmiş bir trombüsü varlığı şeklinde. Ayrıca, trombotik trombositopenik purpura (TTP) olarak – veya inflamatuar microenvironments – ADAMTS13 etkinlik-böyle eksik patolojiler içinde ADAMTS13 etkinliği inhibe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Alison Michels Frederick Banting ve Charles en iyi Kanada Yüksek Lisans Bursu dan Kanada kurumları, Sağlık Araştırma (CIHR) bir alıcı var. Laura L. Swystun alıcının CIHR bursu var. David Lillicrap bir Kanada araştırma sandalyede moleküler hemostaz alıcı olduğunu. Bu çalışmada kısmen grant (paspas-97849) çalışan bir CIHR tarafından finanse edildi.

Materials

Calf-thymus unfractionated histones (UH) Worthington Biochemical HLY Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rich histones (HK) Sigma-Aldrich H5505 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rich histones (HR) Sigma-Aldrich H4830 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 Reconstituted in DMSO (20 mM)
Histamine Sigma-Aldrich H7125-1G Reconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) Invitrogen D273 Reconstituted in methanol (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating Antibody DAKO A0082 For VWF ELISA
Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated DAKO P0026 For VWF ELISA and histone-VWF binding assay
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates eBioscience 44-2404-21 For histone-VWF binding assay
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates Thermo Scientific 3855 For VWF ELISA
Humate-P CSL Behring N/A Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex
Normal Reference Plasma Precision BioLogic CCNRP-05 For VWF ELISA standard curve
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent Sigma-Aldrich P8287 Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 For culturing and initial seeding of BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092
Rat-tail Collagen Type 1 Corning 354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher Scientific 31985070 For endothelial cell stimulations
METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software Molecular Devices N/A
BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive BD Biosciences 366703
µ-Slide III 0.1 (flow chambers) Ibidi This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2
Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized Ibidi 10842
Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized Ibidi 10825
Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized Ibidi 10802
Blunted 18G Needle BD Biosciences 305180
20 mL syringes BD Biosciences 302830
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM N/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope Quorum Technologies N/A
Image Processing Software ImageJ N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, a. B., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel – Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473 (2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384 (2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend’homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

Tags

Keywords: Von Willebrand FactorVWF-platelet String FormationFlow Chamber ModelCollagenEndothelial CellsPlateletsSecretagoguesIn VitroMicroscopySyringe Pump
check_url/cn/55917?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. J. Vis. Exp. (126), e55917, doi:10.3791/55917 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image