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一种基于 Caenorhabditis elegans 营养状态的铜回避行为检测方法

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DOI：

10.3791/55939

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2017年7月26日

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1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

本文内容

摘要

本文介绍一种针对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的特异性检测方法，旨在评估该生物从饱食状态过渡到饥饿状态过程中，其对铜的回避行为以及定位常见食物来源能力的变化。

摘要

为了确保生存，生物体必须能够避开不利的生存环境，同时保证稳定的食物来源。Caenorhabditis elegans 在感知到多种环境刺激后会改变其运动模式，并且能够在饥饿条件下调节其一系列行为反应。线虫在离开食物来源超过30分钟后，通常会表现出厌恶反应的减弱。观察营养状态变化所引起的行为改变，有助于深入了解调控生物从饱食状态向饥饿状态转变的机制。

我们开发了一种检测线虫穿越厌恶屏障能力的实验方法（即 铜）在较长时间内逐渐接近食物源。本方案在先前研究的基础上，通过整合多个变量，使得在生物体逐渐进入饥饿状态的过程中仍能持续收集数据。此外，该检测方法可增加样本量，从而能够同时评估更大数量的线虫群体。

无法感知或响应铜的生物体会立即穿过化学屏障，而野生型线虫最初会被排斥。随着野生型线虫饥饿程度逐渐增加，它们开始穿越屏障并到达食物来源。我们设计了此实验以评估一种无法响应多种环境信号（包括食物感知或有害化学物质检测）的突变体。通过本方案检测时，缺陷型生物体会立即穿过屏障，但同时也无法检测到食物来源。因此，这些突变体即使短暂到达食物源，仍会反复穿越化学屏障。该实验可直接用于检测线虫群体，以评估与厌恶反应和饥饿相关的潜在信号通路缺陷。

引言

Caenorhabditis elegans 数十年来一直被用作神经生物学研究的模式生物，因其仅由302个神经元组成的神经系统回路相对易于分析1。由于该生物依赖于对环境线索作出响应，其大部分神经系统都致力于调控环境信号的整合2。尽管其神经系统结构简单，C. elegans 仍能感知并响应多种环境信号，包括驱避物3、吸引物4、温度5，甚至湿度6。在哺乳动物模型系统中，环境信号整合功能的异常已被证实与多种行为障碍和神经退行性疾病相关7,8,9。随着多种神经疾病模型10在C. elegans中的建立以及线虫药物筛选技术的发展11，该生物已成为神经生物学研究中一个极具价值的系统。鉴于目前已获得完整的线虫连接组图谱1，以及几乎覆盖线虫基因组所有基因的突变体资源12，我们对线虫神经系统（以及由此延伸至人类自身神经系统）的理解，目前在一定程度上受限于设计出具有创新性和适用性的实验方法。

在过去40年中，已开发出多种趋化性实验方法，用于评估线虫对多种厌恶刺激的反应能力3,4,13,14,15。早期实验是在单个线虫在琼脂平板上自由移动时，引入一种急性环境刺激3,14,16，并记录其运动行为的即时变化。例如，可将挥发性气味分子辛醇涂抹于毛发上，并置于线虫头部前方挥动，以诱导野生型线虫启动向后运动17。此外，还开发了更为复杂的实验方法，通过引入多个变量来评估行为选择18。其中一种实验变体采用铜溶液建立厌恶性的中线屏障4，在化学屏障的一侧放置吸引物（如双乙酰），并将线虫放置于远离双乙酰的位置。对铜产生厌恶反应存在缺陷的突变线虫会立即穿过屏障以接近双乙酰，而野生型线虫则最初被屏障排斥。实验评分基于线虫首次接近铜屏障时的反应，无需长期观察。

当线虫经历饥饿条件后进行评估时，其对环境刺激的敏感性会降低19。当将厌恶性化学物质辛醇挥散至线虫头部前方时，野生型个体在有食物存在的情况下，通常在3–5秒内即启动向后运动。当这些个体离开食物10分钟后，其反应时间延迟至8–10秒20。因此，随着饥饿程度增加，线虫对有害环境信号的厌恶反应减弱，因为寻找食物对生存变得更为重要。相反，过表达神经肽受体9（npr-9）的线虫无论在有无食物条件下均不对辛醇产生反应，并表现出对多种厌恶刺激响应能力的缺失21。这些npr-9(GF)个体在食物存在时也无法调节其反向运动频率，但仍能对强烈触觉刺激产生反向运动，表明其具备向后运动的能力21。我们还评估了npr-9(LF)突变体，因其在无食物条件下表现出异常降低的反向运动频率，但在食物存在时仍能调节其行为21。将线虫的营养状态与急性外界刺激相结合，有助于阐明食物相关通路广泛调控感觉信号通路的机制22,23。此外，线虫环境中食物的存在也被用于评估乙醇戒断反应24。在该实验中，线虫被孵育于不同浓度的乙醇中，随后转移至含有食物区域的琼脂平板上，该实验被称为"食物竞赛实验"。食物区域被放置在平板的一侧，而线虫则被置于远离食物源的位置。通过测量线虫到达食物区域所需的时间来评估乙醇戒断反应。

基于营养的铜回避实验在食物竞争实验的基础上进行了改进，整合了食物和铜等额外的环境变量，以评估随时间推移的行为变化。这是对一种常用实验方案的改进，该方案在 throughout 秀丽隐杆线虫 群落4该方案已用于在四小时内评估厌恶反应及食物探测能力21由于线虫在食物剥夺30分钟后即表现出饥饿行为25我们还能够评估营养状态的变化如何影响生物对环境刺激的反应。本实验通过测量实验生物随时间推移对厌恶刺激反应性的变化，从而评估生物在向饥饿状态发展过程中（以及长期饥饿的持续测量中）的行为改变。由于 npr-9(GF) 动物不会因食物或许多有害刺激而改变其行为，因此我们试图确定在饥饿情境下这些行为缺陷是否会持续存在。最终，该实验设计旨在专门评估 npr-9(GF) 突变体，但也可进一步调整以表征新菌株。

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方案

1. 实验生物的准备

  1. 每种品系在开始实验前24小时挑选10只L4期线虫，以确保检测时线虫处于年轻成虫阶段。针对每种待测突变体或对照线虫，分别挑选10只L4期个体（10只用于对照，10只用于实验）。
    1. 采用标准方法培养L4期生物体26,27 在接种了OP50的标准琼脂平板上培养24小时 大肠杆菌如果在后续洗涤步骤中生物体丢失，可通过增加起始样品量来补偿（即 挑选20条而非10条线虫。
      注意：行为是一种天生具有变异性的表型。每种菌株均应在三天不同的日期进行三次重复实验。对于新菌株，应增加额外的对照菌株和实验条件，具体参见讨论部分的说明。
  2. 在检测前立即转移实验用生物体至无菌的琼脂平板上，让线虫自由移动1分钟，以去除多余的细菌。
    1. 若实验生物在检测前24小时内暴露于污染条件下，则应弃用。
  3. 用移液器将1 mL M9加入无菌平板中，冲洗线虫至微量离心管中。
  4. 在 3,000 × g 离心 1 分钟。线虫应在离心管底部形成沉淀。用移液器吸除 M9 溶液，注意不要扰动线虫沉淀。向线虫沉淀中加入 1 mL M9 溶液，倒置离心管以混匀线虫与溶液。
  5. 重复步骤 1.4 三次。
    1. 如果最初随线虫转移了过多的细菌，需重复操作，共计5次。不得将细菌转移至铜食物竞赛平板。若食物被带入检测平板，将干扰数据的准确采集。
  6. 最后一次洗涤后，吸除上清液，直至剩余约100 µL M9培养基和线虫沉淀。
    注意：饥饿相关行为在30分钟后开始显现。因此，一旦洗涤步骤完成，应立即转移线虫至溶液外。

2. 检测板的制备

  1. 在实验前两天制备标准的NGM琼脂平板。
    1. 如果平板保存在潮湿环境中，应在实验前三天制备琼脂平板。或者，在无菌环境下将平板盖子打开3–6小时，以确保充分干燥。
  2. 使用较粗的永久性记号笔，在平板底部外缘画一条线，并画另一条线作为中线屏障（图1）。中线屏障应与平板两侧边缘等距。使用直尺确保测量精确。这些线条在转移细菌和铜溶液时将作为引导线。只要先转移大肠杆菌（E. coli）再添加铜溶液，这些线条即可起到指示作用。
  3. 仅在铜屏障的一侧接种50 µL OP50 E. coli，以形成均匀的菌苔（图2）。各次实验中的细菌浓度应保持一致；然而，轻微的浓度差异对结果影响较小，通常未观察到显著变化。
    1. 利用平板底部的标记线，确保细菌不会与铜溶液接触。只要铜溶液沿平板边缘分布并形成中线屏障，转移细菌时应保证铜溶液不会接触到食物来源。
  4. 另标记一组平板，但不向其上转移任何OP50 E. coli（图2）。这些平板用于设置阴性对照。也应在平板的一半区域做标记，以标明初始转移的起始位置。
  5. 让细菌自然干燥后，将平板在37 °C下过夜培养。在将平板转移至37 °C培养箱或室温环境时，应确保菌斑不被扰动。过度扰动可能改变食物区域的位置或形状。

3. 趋化性实验

  1. 在开始检测前，新鲜配制 0.5 M 硫酸铜（II）溶液。每块板使用 125 µL 该溶液，根据所用检测板的数量按比例增加溶液体积（例如 5 个检测板，625 µL。
  2. 用移液器将 100 µL 硫酸铜（II）溶液加至琼脂边缘，以形成外部铜屏障。应以平板标记的底面作为加样位置的参考。
  3. 用移液器吸取25 µL硫酸铜（II）溶液，形成中线屏障。
    1. 确保硫酸铜（II）溶液不与细菌菌落接触。应采用点样法，因为划线法可能因在琼脂表面产生凹痕或划痕而影响细菌的运动。
  4. 让铜溶液在板上自然晾干。干燥时间可根据板的类型和实验室条件进行调整。转移后每5分钟目视检查一次干燥情况。
    注意：铜溶液呈淡蓝色，易于识别。使用实验室纸巾轻轻蘸取靠近平板边缘的溶液以辨别 干燥性
  5. 用移液器从管底吸取20 µL线虫沉淀，转移到检测平板的无菌区域半侧。
    1. 确保将10条线虫转移至检测平板。若不慎加入过多线虫，需用卤代烃油挑除多余个体，以避免将细菌带入平板。每次检测中，线虫的数量应保持一致。
      注意：若在检测过程中转移的线虫数量过少，可通过增加初始样品量来减少洗涤和转移过程中的潜在损失。
  6. 用实验室纸巾除去平板上多余的M9。M9不得与硫酸铜（II）溶液接触。
    注意：进行此步骤时，应确保线虫及琼脂表面不受影响。若使用过于用力，实验用纸巾可能在培养皿的琼脂表面产生凹痕，并导致线虫被移除。不慎被移除的线虫 通过 KimWipe 应丢弃。
  7. 一旦移除M9溶液且所有线虫开始非液体运动模式，即启动检测计时器。
    1. 最佳情况下，应在1分钟内移除M9溶液。关键参数是识别出正弦波状运动。线虫的运动方式各不相同， 例如 在液体中表现为抽搐式运动而非正弦波状运动。当每个实验生物体停止抽搐时，立即启动测定计时器。
  8. 每30分钟检查一次检测板。
    1. 对于含有细菌菌斑的检测平板，若生物体在4小时内到达食物菌斑，则记为阳性。对于阴性对照平板，若生物体已越过屏障，则记为阳性。

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结果

我们利用野生型（N2）、npr-9(tm1652) 以及 npr-9 过表达菌株，即 npr-9(GF)（IC836 -npr-9::npr-9;sur-5::gfp;odr-1::rfp)，评估其对饥饿和铜回避的反应。野生型生物能够检测并响应厌恶性铜屏障，而 npr-9(GF) 突变体在4小时的检测中不会对铜产生回避反应21。饥饿30分钟后，约50–60%的野生型（N2）生物会穿越铜屏障并到达食物区域；在2小时时间点，75%的野生型线虫到达食物源；到实验结束时，100%的N2生物均已迁移至食物源。相比之下，大多数 npr-9(GF) 生物不会根据食物的存在调节其运动模式，即使接触到食物源，仍持续穿越厌恶性屏障。npr-9(GF) 蠕虫在整个4小时检测期间持续未能根据食物改变其运动行为，在任一时间点仅有30%的测试生物位于食物上。npr-9(LF) 动物的表现虽不如N2生物，但随着饥...

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讨论

该实验设计对食物趋近实验进行了改进24 加入铜溶液以形成令人厌恶的中线屏障，并在培养板边缘添加以防止线虫丢失。在4小时的时间内，检测生物体穿越厌恶屏障并到达食物区域的能力。在……背景下 npr-9(GF)我们已利用该检测方法评估饥饿条件如何影响厌恶反应及食物的感知能力。鉴于我们此前已对 npr-9(GF) 由于对食物和厌恶刺激的反应存在缺陷，我们结合多种环境线索与营养状态，评估饥饿是否能够调节这种缺陷。 npr-9(GF) 行为。该实验依赖于线虫检测和响应化学刺激及食物信号的能力3,4鉴于分析的变量多样，必须严格控制实验生物的条件，以消除混杂因素。对于尚未表征的突变体， 即 对于那些厌恶反应或食物反应未知的品系，需要使用额外的对照品系。厌恶反应缺陷型品系， 例如 che-2 或 odr-328以及在无食...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会发现基金 RGPIN36481-08 资助，授予 William G. Bendena。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
M9 溶液 [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, 加 H2O 至 1 升。使用前高压灭菌。]实验室制备
硫酸铜SigmaC-1297用水适当悬浮至浓度为 0.5 M

参考文献

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