원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학
Summary
우리는 상세한 절차 및 전략 기계적 특성 및 기계적 전개 경로 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자의 측정을 설명 합니다. 우리는 또한 선택과 좋은 단일 단백질 분자 기록의 정당성에 대 한 참조로 대표적인 결과 보여줍니다.
Abstract
그들의 네이티브 3D 구조에 그들의 아미노산 시퀀스 로부터 단백질의 접히는 과정의 결정은 생물학에 있는 중요 한 문제 이다. 원자 힘 현미경 (AFM) 스트레칭과 휴식 단일 단백질 분자의 특정 전개 및 refolding 특성의 직접 증거를 제공 함으로써이 문제를 해결할 수 있습니다. AFM 기반 단일-분자 힘-분광학 AFM-SMF () 일관 되 게 에너지 conformations 전통적인 대량 (생화학) 측정에 가능 하지 않은 단백질을 측정 하는 수단을 제공 합니다. 수많은 논문 AFM SMF의 원리를 보여주는에 게시 된, 하지만 그것은 철저 하 게 완전 한 프로토콜의 부족 때문에 SMF 실험을 실시 쉽지 않다. 이 연구에서 우리는 AFM의 원리를 간단히 설명 하 고 광범위 하 게 세부 프로토콜, 절차, 및 데이터 분석 SMF 실험에서 좋은 결과 달성 하는 지침. 단일 단백질 기계 펼쳐진 측정의 대표적인 SMF 결과 설명 하 고 우리가 제공 하는 문제가 발생 하는 일반적으로 몇 가지 문제 해결 전략.
Introduction
AFM에 의해 단일 분자 힘 분광학 (SMF)에 발전 기계 조작 및 단일 단백질 분자의 정확한 특성화를 활성화 했습니다. 이 특성화 단백질 기계1,2,3, 단백질-리간드 상호작용4, 단백질 단백질 상호 작용5, 접히는 단백질에 대 한 새로운 통찰력을 생산 하고있다 및 단백질 기반 설계 재료6,,78. SMF는 단백질을 공부 하는 데 특히 유용 수 있습니다 제공 하는 지속적으로 증가 윤곽선 길이를 상승 그들의 강성에 따라 점차적으로 확장 하는 단백질 분자 내의 화학 및 물리적 채권 AFM에 의해 기지개로 전개. 단백질 분자의이 잡아당기고 수 파열 이벤트의 결과로 힘 확장 곡선에서 갑작스러운 변환을 (또는 강제로 피크). 강제로 피크 기계적 전개 과정에서 단백질의 펼쳐 힘 및 구조 변화에 직접 정보를 제공합니다. AFM을 사용 하 여 첫 번째 연구 중 하나 titin1 을 측정 하 고 전개 하 고 집중된 화학 물질 또는 극단적인 온도 같은 부자연 스러운 denaturants의 사용 없이 생리 적인 조건 하에서 refolding 단백질의 새로운 측면을 발견.
여기 우리가 고려만 AFM SMF 실험 다양 한 악기에 수행 됩니다. AFM은 4 개의 주요 요소로 구성: 프로브, 검출기, 샘플 홀더 및 압 전 스캐너. 프로브는 캔틸레버의 중세 끝에 날카로운 끝 이다. 교정, 후 연결 된 분자의 스트레칭 하는 동안 캔틸레버의 휨 측정 된다 Hooke의 법률을 사용 하 여 힘을 정확 하 게 결정 하는 캔틸레버의 뒤쪽에서 반영 되는 레이저 빔을 사용 하 여. 레이저 빔 다이오드 센터에서의 변위에 비례하여 전압을 생성 하는 사분면 포토 다이오드 검출기에 반사 된 레이저 빔 프로젝트. 액체에 단백질 샘플 기판 하위 나노미터 정밀도로 제어할 수 있는 3 차원 압 전 단계에 거치 된다. 컴퓨터 포토 다이오드 감지기에서 전압을 읽는다 고 컴퓨터 제어 전압 공급을 통해 3D 단계를 제어 합니다. 이러한 압 전 액추에이터 단계는 일반적으로 장착 용량 성 또는 스트레인 게이지 위치 센서 정확 하 게 측정 압 전 변위 및 피드 백 제어 시스템을 통해 정확한 히스테리시스. 압 전 컨트롤러에서 센서 신호 출력은 공장에서 캘리브레이션 된 압 전 전압 상수를 사용 하 여 거리 변환 됩니다. 당기는 실험에서 예 힘 확장 곡선 그림 2에 표시 됩니다.
AFM SMF 실험의 두 가지 유형이 있다: 일정 한 속도 지속적인 힘 측정을 당기. 지속적인 힘 SMF 측정 Oberhauser 외 에 설명 되어 있습니다. 9, 여기 우리가 일정 속도 측정에 집중 하는 동안. 전형적인 AFM 상수 속도 당기 실험 기판 캔틸레버 끝에 상대적으로 부드럽게 이동 하는 압 전 전압을 제공 하 여 수행 됩니다. 전형적인 실험 표면에 대해 처음 누르면 팁이 있다. 당기 측정 접촉에서가지고 팁에서 기판으로 이동 하 여 시작 됩니다. 단백질 처음 팁의 접촉으로 온다, 당겨 질 것 이다 하 고 변위에 대 한 힘의 펼쳐진 추적 측정 됩니다. 기판은 다음 팁 접촉 돌아온 것 고 편안한 추적 어디 단백질 접기 결정 될 수 있다 힘 변위에서 측정 된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜에 중요 한 단계는 “지문” 단일 분자 이벤트를 긍정적인 통제 역할 단계 1.1.2에서에서 설명 하는 polyprotein의 사용 이다. 일반적으로, 거기 한다 밝혀지고 있을 polyprotein 단백질의 이벤트 (I91, 즉 약 28의 약 200 pN 및 윤곽선 길이 증가의 펼쳐진 힘 nm) 관심사의 단백질의 접힌 되었습니다는 명확 하 게 결론. 예를 들어 때 관심사의 단백질은 양쪽에서 3 개의 I91 도메인에 의해 형벌 이다, 다음 있?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 재단 교부 금 인 m c B-1244297 및 MCB-1517245 PEM에 의해 지원 되었다.
Materials
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
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