Изоляции клеток эндотелия прародителем от человеческой пуповинной крови
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в изоляции эндотелиальной прогениторных клеток из пуповинной крови. Некоторые из приложений включают, используя эти клетки в качестве биомаркеров для выявления пациентов с сердечно-сосудистого риска, лечение ишемической болезни, и создание ткани инженерии сосудов и сердца клапан конструкций.
Abstract
Существование эндотелиальной прогениторных клеток (ПЭК) в периферической крови и ее участие в vasculogenesis был впервые сообщил Ашара и коллеги-1. Позже другие документированы существование аналогичных типов Пэк, происходящих из костного мозга2,3. Совсем недавно Йодер и Ингрэм, показал, что Пэк вытекает из пуповинной крови был выше пролиферативный потенциал, по сравнению с них изолированы от взрослого периферической крови4,5,6. Помимо участия в послеродовом vasculogenesis, Пэк также показали обещание как источник клеток для создания ткани инженерии сосудов и сердца клапан конструкции7,8. Существуют различные протоколы изоляции, некоторые из которых связаны с сортировки мононуклеарных клеток (МНК), полученные из источников, упомянутых ранее с помощью маркеров эндотелиальной и гемопоэтических клеток, или культивирование эти МНК с специализированный эндотелиальной роста Средний, или сочетание этих методов9. Здесь, мы представляем собой протокол для изоляции и культуры ПЭК с помощью специализированных эндотелиальной среднего дополнена факторов роста, без использования immunosorting, следуют характеристика изолированных клеток, используя Западный blotting и иммуноокрашивания.
Introduction
Некоторые следователи изучили характеристики и потенциал человека Пэк5,10,11,12,13. Пэк может быть описана как циркулирующих клеток, которые имеют возможность присоединиться к эндотелиальной тканей в местах гипоксии, ишемии, травмы или образования опухоли и способствовать формированию новых сосудистых структур4,14. Их наблюдаемых участие в неоваскуляризация, в форме послеродовой vasculogenesis, привело к пониманию патофизиологии этих клеток и их использования в терапевтического применения4,15, 16. количество Пэк в лицо было показано, быть связаны с сердечно-сосудистой патологии9,,1516,,1718,19 ,20. Другие исследования также дифференцированы Пэк в клапан фибробластоподобных фенотип и предложил, что эти клетки могут использоваться для тканевой инженерии сердца клапаны7,21.
Конкретной ячейке поверхности молекул, необходимо изолировать Пэк не были четко определены из-за расхождений между исследования4. Адгезии МНК к матрице, с воздействием различных условий культуры, было выполнено несколько групп1,17,22,23, предполагая, что предполагаемый Пэк может Отображение различных фенотипических свойств. Эти свойства включают в себя отсутствие phagocytotic способности, формирования трубки в Matrigel и поглощение Dil ацетилированные уровня липопротеидов низкой плотности. Два свойства с которой Пэк может быть структурировано5высокий колониеобразования и пролиферативным потенциалом. Пэк могут также образовывать в vitro трубочки, когда cocultured с человеческих легких плода фибробластов4. Эти клетки, как известно, чтобы выразить эндотелиальных клеток поверхностных маркеров и поделиться некоторыми из гемопоэтических маркеры13,24,25. Положительно выраженное маркеров, которые широко принимаются фенотипирование Пэк, CD31, CD34, Сосудистый эндотелиальный фактор роста рецепторов 2 (VEGFR2), Виллебранда фактор (vWF), CD133, c комплект и сосудистого эндотелия Кадгерины (VE-Кадгерины)4 , 18. клетки, которые совместно Экспресс CD90, CD45, CD14, CD115 или альфа гладких мышц актина (α-SMA) не считаются Пэк из-за их ограниченного пролиферативный потенциал, способность фагоцитоз бактерий и неспособности сформировать de novo человека судов в vivo4,7. Эта статья конспектирует измененный Протокол для изоляции клеток эндотелия прародителем от человеческой пуповинной крови без необходимости в любую ячейку Сортировка протоколы. Для этой статьи мы использовали CD31, CD34 и VEGFR2 как положительных маркеров, с α-SMA как отрицательный показатель.
В этой статье мы предлагаем, что метод изоляции и культивирования эндотелиальной прогениторных клеток из пуповинной крови без ячеек, сортировка с использованием специализированных среднего роста эндотелия сосудов, дополнена факторов роста (СГЭ). Этот внеочередного общего собрания акционеров содержит Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и фактор роста фибробластов (ФБП), которые увеличивают миграцию эндотелиальных клеток26выживания и распространения. Она также включает в себя аскорбиновую кислоту, которая отвечает за поддержание булыжником морфологию клеток; инсулиноподобный фактор роста-1 (ИФР-1), которая обеспечивает ангиогенных и мигрирующих функции; и гепарин, который вызывает повышение долгосрочной стабильности факторов роста в среднесрочной26. Другие факторы роста, добавляется эндотелиальных клеток питательной среды включает в себя добавки с эпидермального фактора роста (EGF), который помогает в стимулировании пролиферации и дифференциации и гидрокортизон, который знакомит клетки EGF26 . Мы покажем, что использование этой конкретной роста среднего дает более высокие числа Пэк, по сравнению с эндотелиальной базальной средний (МВБ) или Дульбекко изменение средних орла (DMEM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Как упоминалось ранее, сторонник Пэк обладают булыжником морфологии. Наши изолированные МНК перешла от колонии веретеновидной формы клеток (рис. 2A-2D) на ранних стадиях булыжником колонию (Рисунок 2E-2F) в течение десяти дней в культуре. Пэ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот материал основан на работе, поддержке Национального научного фонда под Грант № CMMI-1452943 и отличием колледж университета штата Арканзас. Мы хотели бы также признать Арканзас пуповинной крови Банк за предоставление нам единиц крови шнура.
Materials
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1X Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10X Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10X Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4X Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105 (1), 71-77 (2000).
- Shi, Q., et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 92 (2), 362-367 (1998).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114, 193-199 (2006).
- Sales, V. L., et al. Endothelial Progenitor Cells as a Sole Source for Ex Vivo Seeding of Tissue-Engineered Heart Valves. Tissue Eng Pt A. 16 (1), 257-267 (2010).
- Liew, A., Barry, F., O’Brien, T. Endothelial progenitor cells: diagnostic and therapeutic considerations. Bioessays. 28 (3), 261-270 (2006).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Ingram, D. A., Caplice, N. M., Yoder, M. C. Unresolved questions, changing definitions, and novel paradigms for defining endothelial progenitor cells. Blood. 106 (5), 1525-1531 (2005).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 006692 (2012).
- Siddique, A., Shantsila, E., Lip, G. Y. H., Varma, C. Endothelial progenitor cells: what use for the cardiologist. J Angiogenes Res. 2 (6), (2010).
- Camci-Unal, G., et al. Surface-modified hyaluronic acid hydrogels to capture endothelial progenitor cells. Soft Matter. 6 (20), 5120-5126 (2010).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Young, P. P., Vaughan, D. E., Hatzopoulos, A. K. Biologic properties of endothelial progenitor cells and their potential for cell therapy. Prog Cardiovasc Dis. 49 (6), 421-429 (2007).
- Mehta, J. L., Szwedo, J. Circulating endothelial progenitor cells, microparticles and vascular disease. J Hypertens. 28 (8), 1611-1613 (2010).
- Nevskaya, T., et al. Circulating endothelial progenitor cells in systemic sclerosis are related to impaired angiogenesis and vascular disease manifestations. Ann Rheum Dis. 66, 67-67 (2007).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, 132-137 (2006).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Vasa, M., et al. Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease. Circulation. 103 (24), 2885-2890 (2001).
- Wu, X., et al. Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 480-487 (2004).
- Boyer, M., et al. Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg. 31 (1), 181-189 (2000).
- Huber, B., Czaja, A. M., Kluger, P. J. Influence of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone on the co-culture of mature adipocytes and endothelial cells for vascularized adipose tissue engineering. Cell Biol Int. 40 (5), 569-578 (2016).
- Sturdivant, N. M., Smith, S. G., Ali, S. F., Wolchok, J. C., Balachandran, K. Acetazolamide Mitigates Astrocyte Cellular Edema Following Mild Traumatic Brain Injury. Sci Rep. 6, 33330 (2016).
- Lam, N. T., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N., Balachandran, K. Valve interstitial cell contractile strength and metabolic state are dependent on its shape. Integr Biol (Camb). 8 (10), 1079-1089 (2016).
- Tandon, I., et al. Valve interstitial cell shape modulates cell contractility independent of cell phenotype. J Biomech. 49 (14), 3289-3297 (2016).
- Cockshell, M. P., Bonder, C. S. Isolation and Culture of Human CD133+ Non-adherent Endothelial Forming Cells. Bio-Protocol. 6 (7), (2016).
