基于CRISPR/Cas9的原始生殖细胞移植实现育种跨越式发展 非洲爪蟾

摘要

对生存至关重要的基因在创建突变品系时会带来技术上的困难。跳跃式基因编辑技术通过将基因组编辑与原始生殖细胞移植相结合，可绕过致死效应，从而产生携带生殖系突变的野生型动物。该技术还能够在F₁代高效地生成纯合无效突变体。本文展示了其中的移植步骤。

摘要

通过基因组编辑创建突变品系正在加速多种生物的遗传学分析。CRISPR/Cas9 技术已应用于非洲爪蟾， 非洲爪蟾，长期以来作为生物医学研究的模式生物。利用CRISPR/Cas9靶向诱变技术创建纯合突变品系的传统育种方案包含多个耗时且劳动密集的步骤。为促进突变胚胎的制备，特别是克服在敲除对胚胎发育至关重要的基因时所面临的困难，研究人员开发了一种名为“跳跃式遗传”（leapfrogging）的新方法。该技术利用了 非洲爪蟾 胚胎至 "剪切并粘贴" 胚胎学方法。Leapfrogging 技术利用将高效诱导突变的供体胚胎中的原始生殖细胞（PGCs）移植到经 PGC 消除处理的野生型同胞受体胚胎中。该方法通过构建体细胞为野生型而生殖系携带突变的嵌合个体，实现对必需基因的高效突变。当两个 F₀ 携带的动物 "跳跃式移植" (即， 突变的生殖细胞相互杂交后，会产生纯合子或复合杂合子的无效F₁ 胚胎，从而节省整整一个世代的时间来获取表型数据。Leapfrogging 还为分析母体效应基因提供了新方法，这类基因对传统的 F₀ CRISPR/Cas9诱变后的表型分析。本文详细描述了跳跃式克隆（leapfrogging）方法，重点阐述如何成功进行原始生殖细胞（PGC）移植。

引言

自孟德尔定律被重新发现以来，基因型如何编码表型一直是生物学的核心问题。深入理解基因的作用、基因调控及其在基因网络中的相互作用，以及编码产物的功能，有望为揭示新的生物学机制和改善疾病状态提供有力工具。半个多世纪以来¹，非洲爪蟾， 非洲爪蟾，长期以来一直是基础生物学和生物医学诸多领域研究的重要模式生物，包括发育的遗传调控。历史上，大多数关于 非洲爪蟾 已使用异源四倍体蛙， X. laevis但最近由于其二倍体特性， X. tropicalis 已开发为两栖类遗传学模型。已从两者中完成基因组序列的组装 非洲爪蟾 物种^2,3。该 "蛙类群落" 正处于一个转折点，此时基础的基因组编辑技术已能够几乎随心所欲地研究基因功能。可编程的CRISPR/Cas9核酸酶使得基因诱变效率显著提高，且在大多数动物细胞中均可实现双等位基因突变^{4,5,6,7,8,....}

方案

本文所述所有方法均已获得加州大学欧文分校机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 原始生殖细胞移植的准备工作

1. 提前准备好解剖工具，方法如前所述。²³.
   注意：进行手术时，使用眉毛刀片在毛发环的辅助下进行切口，以稳定胚胎。眉毛和毛发环需用胶粘在已用火焰拉制并在变细处折断的硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管上（参见 图1A，箭头）以形成更短、更窄的尖端（图1B) 以在进行手术时获得更高的灵巧性。
2. 使用先前所述的方法生成sgRNA²⁴ .
   注意：简而言之，使用包含5'噬菌体T7启动子的互补脱氧寡核苷酸退火生成编码sgRNA的短DNA模板， "已填写" 由一种无错配的耐热DNA聚合酶完成。 体外 sgRNA合成反应孵育数小时至过夜（具体时间取决于所用试剂盒）。反应产物经DNA酶处理以去除模板。根据试剂盒制造商的说明，sgRNA通过苯酚/氯仿抽提和乙酸铵/异丙醇沉淀等标准方法进行纯化。²⁴.
3. 在进行显微注射前不久，首先在3 µL无RNase（经焦碳酸二乙酯处理）的H₂O中变性约250 ng的sgRNA，制备Cas9-....

结果

移植后，在投入精力进行动物饲养以将动物培育至性成熟之前，应先对CRISPR/Cas9诱变效果进行定性评估。由于携带leapfrog移植的动物在体细胞中为野生型，且其生殖系难以直接取样检测，因此保存供体胚胎的尸体显得尤为重要。通过对尸体提取DNA进行分析，可间接反映移植生殖系中发生的诱变程度¹⁷。

评估诱变效果的一种方法是直接测序跨越目标基因组区域的PCR扩增子。如果需要对来自多个动物的大量单个克隆DNA片段进行测序，则该方法将变得尤为昂贵且效率低下。相比之下，可对来源于基因型嵌合胚胎、在靶位点具有异质性的扩增子进行测序，以评估每个胚胎中的诱变效率¹⁹。染色图谱的可视化结果显示，在靶序列上游为野生型序列（峰形清晰），而在Cas9催化的双链断裂位点下游，峰形则变得“混乱”（即每个核苷酸位置上出现对应多个碱基的峰共同存在）。此类.......

讨论

本报告提供了一种详细的含有原始生殖细胞（PGCs）的植物组织移植方案。PGCs的移植可与基因组编辑技术（例如，CRISPR/Cas9）结合使用，以在几乎保持动物所有体细胞为遗传野生型的同时，对其生殖系进行修饰。为了成功实现跨代遗传，实施移植前需考虑若干关键因素。

为确保生殖系被突变等位基因完全替换，建议首先确定 体内 sgRNA的效率。经验表明，使用CRISPRDirect（https://crispr.dbcls.jp/）或CRISPRScan（http://www.crisprscan.org/）设计的大多数sgRNA在每胚胎注射250 pg时即具有较高效率。然而，在某些情况下，可能需要使用更高浓度（例如，该 gsc Blitz 等人发表的 sgRNA¹⁷，所需量约为每胚胎1 ng）。评估靶位点的突变效率至关重要，而使用TIDE可实现定量分析³¹. 本文重点介绍的方法采用直接对PCR扩增子进行Sanger测序（代.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜蒙特 #5 镊子	精细科学工具公司	11252-20 或 11252-30
眉毛刀			自制
毛发环			自制
巴斯德吸管，硼硅酸盐玻璃	费舍尔科技公司	13-678-20A
Krazy Glue（基于氰基丙烯酸酯）	埃尔默产品公司	KG581	用于将眉毛和毛发环固定在巴斯德吸管中，也可使用其他类似的胶水。
定制寡脱氧核苷酸	集成DNA技术公司	定制订购	sgRNA合成所用的模板寡核苷酸，设计细节参见Nakayama等，2014年。
Megascript T7 试剂盒	Ambion/赛默飞世尔科技	AM1334	也可使用Megashortscript T7（AM1354）试剂盒
Tris缓冲酚			来自任何商业供应商的高质量蒸馏酚
氯仿			来自任何商业供应商的高质量氯仿
乙醇			来自任何商业供应商的高质量乙醇
焦碳酸二乙酯（DEPC）	西格玛化学公司	D5758-50ML
Cas9蛋白，含核定位信号	PNA Bio公司	CP01	按照生产商建议，使用DEPC处理水重悬
10倍浓度Marc's改良Ringer溶液			自制。1倍浓度MMR溶液（不含EDTA）配方（参考文献26）：100 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgSO₄、2 mM CaCl₂、5 mM HEPES。调节pH至7.4。
琼脂糖			任何分子生物学级琼脂糖均可满足要求
60 mm × 15 mm 培养皿	Falcon	351007
24孔板	Falcon	3047
L-半胱氨酸	西格玛化学公司	C7352-100G	游离碱形式，非盐酸盐
蛋白酶K	罗氏公司	03 115 828 001	通常来自罗氏，浓度约为20 mg/mL
sera Micron	sera		蝌蚪饲料。在生长培养基中重悬。可通过多种在线零售商购买