In Vitro Caractérisation des propriétés électrophysiologiques des fibres afférentes du côlon chez le rat
Summary
Fonction sensorielle anormale sous-tend la douleur viscérale et autres symptômes de maladies intestinales inflammatoires et fonctionnelle. Un protocole pour l’enregistrement électrophysiologique des nerfs afférents coliques dans une préparation de rectum ex vivo rat est présenté ici.
Abstract
Dysfonction des nerfs sensitifs du côlon a été impliquée dans la pathophysiologie de plusieurs conditions communes, notamment le diabète et les maladies intestinales inflammatoires et fonctionnelle. Nous décrivons ici un protocole pour la caractérisation in vitro des propriétés électrophysiologiques des afférences coliques chez le rat. Le rectum, avec le ganglion pelvien intact (PG), attaché, on retire le rat ; superfusés avec carbogenated une solution de Krebs dans la chambre d’enregistrement ; et canulés aux extrémités afin de permettre une distension orale et anales. Un faisceau de nerfs fine émanant de la PG est identifié et l’activité nerveuse afférente principe est enregistrée à l’aide d’une électrode d’aspiration. Distension du segment colique provoque des augmentations progressives en principe décharge. Une analyse en composantes principales est menée pour différencier le bas seuil, le seuil haut et les fibres afférentes de gamme grande dynamique. Sensibilité chimique des afférences du côlon peut être étudiée par l’administration bain / intraluminale des composés d’essai. Ce protocole peut être modifié pour l’application à d’autres espèces, telles que la souris et le cobaye et d’étudier les différences dans les propriétés électrophysiologiques des afférences hypogastrique/thoraco-lombaire et lombo-sacrée/pelvienne du côlon descendant dans des conditions normales et certaines pathologies.
Introduction
Le tractus gastro-intestinal (TGI) est richement innervé par les nerfs afférents extrinsèques qui transmettent des signaux sensoriels de l’intestin vers le système nerveux central et qui contribuent à l’interaction cerveau-intestin. Excitabilité altérée de ces afférences extrinsèques, ainsi qu’altération Centre de traitement des entrées afférentes, sous-tend la douleur viscérale et autres symptômes de GI conditions, y compris fonctionnels et inflammatoires de l’intestin maladies1. L’information sensorielle de la rectum est véhiculée principalement par le biais de la thoraco-lombaire/hypogastrique et les nerfs lombo-sacrée/pelvienne (PN)2. Il y a eu un intérêt accru en étudiant les propriétés électrophysiologiques des ces fibres afférentes primaires dans les modèles de maladies rongeurs. Cependant, in vivo des enregistrements électrophysiologiques des afférences du côlon chez les rongeurs est un défi technique et requiert des compétences chirurgicales considérables. En outre, les modifications hémodynamiques, le mouvement du tissu et anesthésiques peuvent également avoir des répercussions l’activité nerveuse et sensibilité pour tester des stimuli en vivo. Par conséquent, ces dernières années, un nombre croissant d’études ont employé in vitro (ex vivo) préparations de différentes espèces, y compris les souris, rats, cobayes et l’homme, pour étudier les mécanismes de transduction sensorielle en colique afférences et l’excitabilité altérée dans les états pathologiques. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Ont principalement deux types d’ex vivo la préparation colique : la préparation de « plat-feuille »5,9,10 et le « tube » préparation3,4. Un protocole vidéo pour la préparation de rectum murin « plat-feuille » a été publiée précédemment11. Dans le présent protocole, le rectum de souris, avec le PN) ou des nerfs splanchniques lombaires (LSN) attachés, est récolté et superfusée dans une chambre de tissu. Le rectum est découpé longitudinalement, et le faisceau de nerfs se prolonge dans un compartiment d’enregistrement rempli d’huile de paraffine. L’activité nerveuse est enregistrée à l’aide d’une électrode de platine-iridium monopolaire. Le protocole permet l’identification des champs réceptifs des fibres afférentes individuels en utilisant non biaisée de la stimulation électrique. Elle localise à la demande des stimuli chimiques, ainsi que l’application des paradigmes différents de stimulation mécanique (p. ex., focale muqueuse sonder et circonférentielle stretch), à des terminaisons nerveuses afférentes. Parce que le nerf doit être étendu à une chambre séparée de la chambre de tissu, il est essentiel de garder le nerf ci-joint relativement long ; la dissection réussie des nerfs pose un défi à ceux nouvelle à cette méthodologie. Plus récemment, Nullens et coll. publié un protocole vidéo pour l’enregistrement in vitro des afférences mésentériques murine jéjunale et segments du côlon12. Dans cette préparation « tube », le segment de l’intestin avec le mésentère attaché est gardé intact, permettant ainsi de distension graduée et l’administration intra – et extra-luminale de différents produits chimiques. Depuis le nerf du mésentère est enregistré à l’aide d’une électrode d’aspiration, qui peut être positionnée à proximité du tissu, activité afférente peut être enregistrée, même si le nerf du mésentère est relativement court. Toutefois, le nerf du mésentère se compose de peuplements mixtes de vagales et la colonne vertébrale des fibres afférentes qui innervent le jéjunum ou thoraco-lombaire hypogastrique. Lombo-sacrée afférences pelviens innervant le rectum, qui ne peuvent pas être distinguée dans le présent protocole. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’enregistrement électrophysiologique des afférences colique de rat à l’aide de la préparation du rectum « tube » avec un PG intact Cette méthode peut permettre la caractérisation des propriétés fonctionnelles des lombaires splanchnique (hypogastrique) et lombo-sacrée afférences pelvienne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici est une méthode expérimentale relativement simple pour évaluer les propriétés électrophysiologiques des afférences du côlon de rats. Le protocole (à partir de la dissection des tissus à mettre en place l’enregistrement de nerf) dure environ 2 h pour terminer. Prélèvement tissulaire (étape 3) et la préparation de l’électrode d’aspiration (étape 5) sont des opérations critiques. Il est crucial de pouvoir localiser le PG, le NSE et le PN et à prendre soin de ne pas pour en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce protocole a été soutenu par des subventions de recherche de la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (#31171066, #81270464) et du centre de Science de Sino-allemand (GZ919).
Materials
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
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