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生物学

Pflege, Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infizierte

Published: August 14, 2017
doi:
10.3791/56124
, , , ,
1School of BioSciences,Bio21 Institute and University of Melbourne

Summary

Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infiziert werden in natürlichen Populationen zu unterdrücken, die Übertragung von Arboviren freigesetzt. Wir beschreiben Methoden nach hinten Ae. Aegypti mit Wolbachia Infektionen im Labor für Experimente und Feld Freigabe, Vorsichtsmaßnahmen zum Labor Anpassung und Auswahl zu minimieren.

Abstract

Aedes Aegypti Moskitos experimentell infiziert mit Wolbachia sind in Programme, um die Ausbreitung von Arboviren wie Dengue-Fieber, Chikungunya und Zika genutzt. Wolbachia-infizierte Mücken ins Feld, entweder Populationsgrössen durch inkompatible Paarungen zu reduzieren oder Populationen mit Mücken zu verwandeln, die refraktär gegenüber Übertragung des Virus sind freigegeben werden können. Für diese Strategien, um erfolgreich zu sein müssen die Mücken, die in das Feld aus dem Labor entlassen mit einheimischen Mücken wettbewerbsfähig sein. Jedoch kann Pflege Mücken im Labor führen Inzucht, genetische Drift und Labor-Anpassung, die kann ihre Fitness im Bereich reduzieren und kann die Ergebnisse von Experimenten verwirren. Um die Eignung der verschiedenen Wolbachia Infektionen für den Einsatz im Feld zu testen, ist es notwendig, die Mücken in einer kontrollierten Laborumgebung über mehrere Generationen hinweg zu erhalten. Wir beschreiben ein einfaches Protokoll für die Aufrechterhaltung der Ae. Aegypti Moskitos in das Labor, das für beide Wolbachiaeignet-infizierten und Wildtyp Mücken. Die Methoden minimieren Labor Anpassung und Umsetzung Auskreuzung um die Bedeutung der Experimente für Feld Mücken zu erhöhen. Darüber hinaus werden Kolonien unter optimalen Bedingungen zu maximieren Sie ihre Fitness für Freiland Versionen beibehalten.

Introduction

Aedes Aegypti Moskitos sind verantwortlich für die Übertragung von einigen der wichtigsten Arboviren in der Welt, einschließlich Zika, Dengue-Fieber und Chikungunya1. Diese Viren sind eine zunehmende Bedrohung für die globale Gesundheit immer, da die weite Verbreitung von Ae. Aegypti in den Tropen weiterhin2,3,4zu erweitern. Weibliche Ae. Aegypti bevorzugt ernähren sich von menschlichem Blut5 und somit Leben in unmittelbarer Nähe zu den Menschen, insbesondere in städtischen Gebieten, wo die Populationen dichteste sind, tendenziell. Durch diese enge Verbindung mit den Menschen haben sie auch angepasst, um in künstlichen Lebensräumen, einschließlich Reifen, Töpfe, Dachrinnen und Wasser Behälter6,7zu züchten. AE. Aegypti anpassen auch leicht, Laborumgebungen, wo sie ohne spezielle Anforderungen beibehalten werden kann, nachdem er direkt aus der Praxis, im Gegensatz zu einigen anderen Arten in der Aedes Gattung8gesammelt, 9,10. Ihre Mühelosigkeit der Wartung hat gesehen, wie sie weit in das Labor in den unterschiedlichsten Bereichen studiert, letztlich mit dem Ziel, die Moskitos Krankheiten zu steuern übertragen kann.

Traditionell, stützt arbovirale Kontrolle sich auf den Einsatz von Insektiziden, Moskito-Populationen zu reduzieren. Allerdings gibt es zunehmende Interesse an Ansätze wo modifizierte Mücken im Labor gezüchtet und dann in natürlichen Populationen freigegeben sind. Freigegebene Mücken können gentechnisch11,12,13, biologisch14,15, durch Bestrahlung16, chemische Behandlung17,18, oder in Kombination mit Techniken19 um Populationen von Moskitos zu unterdrücken oder ersetzen Sie sie durch Mücken, die refraktär gegenüber arbovirale Getriebe20sind.

Wolbachia sind Bakterien, die derzeit als eine biologische Schädlingsbekämpfungsmittel für Arboviren. verwendet werden Mehrere Stämme von Wolbachia worden in Ae. Aegypti experimentell mit embryonalen Mikroinjektion21,22,23,24vor kurzem eingeführt. Diese Belastungen reduzieren die Fähigkeit von Arboviren zu verbreiten und zu replizieren im Moskito, verringern ihre Übertragung potenzielle23,25,26,27,28 . Wolbachia Infektionen sind von Mutter auf Kind, übertragen, jedoch bestimmte Stämme Sterilität verursachen, wenn infizierte Männchen paaren sich mit nicht infizierten Frauen22. Wolbachia-infizierte Männer daher in großen Mengen nach natürlichen Moskito Populationen, wie kürzlich in anderen Aedes -Arten15,29demonstriert unterdrücken freigegeben werden können. Jedoch da Wolbachia auch hemmen arbovirale Übertragung in Ae. Aegypti, können Mücken auch freigegeben, um heimische Populationen mit ärmeren Vektoren zu ersetzen. Ae. Aegypti mit Wolbachia experimentell infiziert werden jetzt in das Feld in mehrere Länder, in denen dieser letzteren Ansatz14,30,31veröffentlicht.

Wolbachia-basierte Ansätze zur arbovirale Steuerung verlassen Sie sich auf ein fundiertes Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Wolbachia, die Mücke und der Umwelt. Wolbachia kommen natürlicherweise in ein breites Spektrum von Insekten, und die Stämme in Mücken eingeführt sind vielfältig in ihren Auswirkungen32. Da neue Wolbachia Infektionstypen in Ae. Aegypti24eingeführt sind, ist es notwendig, jede Belastung auf ihre Auswirkungen auf Moskito Fitness, Reproduktion und arbovirale Eingriffe unter einer Reihe von Bedingungen zu charakterisieren. Rigorose Experimente im Labor muss deshalb das Potenzial für Wolbachia Belastungen im Bereich erfolgreich zu bewerten.

Freiland-Versionen von Ae. Aegypti mit Wolbachia Infektionen können erfordern oft, dass Tausende bis Zehntausende von Mücken pro Freigabe Zone werden jede Woche14,30,31aufgezogen. Der Erfolg der ersten Releases kann verbessert werden, durch die Freigabe von Mücken von einer großen Größe ihre Fruchtbarkeit33 und Paarung Erfolg34,35maximieren. Mücken sollten auch die Gegebenheiten angepasst werden, die sie erleben werden, im Feld, aber langfristige Labor Aufzucht verursachen Veränderungen im Verhalten und Physiologie die Bereich Leistung36,37auswirken könnte, 38.

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll für die Aufzucht von Ae. Aegypti im Labor mit Grundausstattung. Dieses Protokoll eignet sich für beide Wildtyp und Wolbachia-infizierten Mücken, von denen die letztere erfordern besondere Aufmerksamkeit, können da einige Wolbachia Stämme erhebliche Auswirkungen auf Moskito Lebensgeschichte Eigenschaften39, haben 40. die Aufzucht Bedingungen zu vermeiden, Überbelegung und Nahrungskonkurrenz Mücken eine einheitliche Größe zu produzieren, die ist entscheidend für Vektorkompetenz und Fitness Experimente und sorgt dafür, dass die Mücken gesund für Feld Release41 sind . Wir auch Vorkehrungen treffen, um Labor Anpassung und Inzucht durch Verringerung der selektiven Druck zu minimieren und sicherzustellen, dass die nächste Generation wird aus einem großen, zufällige Pool gesampelt. Jedoch Laborumgebungen unterscheiden sich deutlich von Feldbedingungen und langfristige Wartung unter ausgeruhten Bedingungen reduzieren könnte die Fitness der Mücken nach Freigabe in das Feld37,42,43 . Daher überqueren wir Frauen von Labor-Linien bis Feld gesammelt Männchen in regelmäßigen Abständen, was in Kolonien, die genetisch ähnlich für experimentelle Vergleiche sind und das Ziel Bereich Bevölkerung39angepasst sind. Die Methoden erfordern spezielle Ausrüstung und können nach hinten zig Tausenden von Individuen pro Woche für Freisetzungen hochskaliert werden. Das Protokoll priorisiert auch die Fitness der Moskitos innerhalb und zwischen den Generationen, ein wichtiger Aspekt für Insekten, die für die Einrichtung in natürlichen Populationen bestimmt. Das Protokoll ist geeignet für die meisten Labors, die erfordern Wartung von Ae. Aegypti, besonders für experimentelle Vergleiche, wo eine gleichbleibende Qualität der Mücken und Beziehbarkeit zum Feld sind wichtig.

Protocol

Blut Fütterung der Moskitos am Menschen wurde von der University of Melbourne menschliche Ethik-Kommission genehmigt (Genehmigung Nr.: 0723847). Alle Freiwilligen zur Verfügung gestellt Einwilligung schriftliche. 1. Larvenstadium Aufzucht Hinweis: Die Mücken sind in 26 ± 0,5 ° C und 50-70 % Relative Luftfeuchtigkeit, mit einem 12:12 h (Licht: dunkel) Photoperiode für diese Kolonie Wartungsprotokoll statt. Diese Bedingungen sind ähnlich wie die durchschnittliche…

Representative Results

Abbildung 4 zeigt die Auswirkungen der suboptimale Ernährung auf die Entwicklung von Ae. Aegypti Larven. Wenn Container verfügen über 0,25 mg Futter pro Larve pro Tag oder weniger, die Entwicklungszeit erhöht für Männer und Frauen, und ist weniger synchron als im Container mit 0,5 mg von Lebensmitteln versehen. Wenn angemessener Nahrung nicht während der gesamten Dauer der Larvalentwicklung erfolgt, hätte dies negative Auswirkungen auf den Ze…

Discussion

Nach dem Protokoll hier vorgestellten für die Wartung von Wolbachia-infizierten Ae. Aegypti sollten sicherstellen, dass gesunde Mücken eine gleich bleibende Qualität für Experimente entstehen und Freisetzungen zu öffnen. Im Gegensatz zu anderen Protokollen, die die Produktion von großen Mengen von Mücken priorisieren (siehe Referenz-57), sind die Methoden konzentriert sich auf die Maximierung ihrer Fitness, sowohl innerhalb der Generationen durch entspannte Aufzucht Durchf…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir erkennen Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson und Clare Doig für ihre Beiträge zur Entwicklung unserer Kolonie Wartung Methoden und drei anonymen Gutachtern für ihre Vorschläge, die dazu beigetragen, um das Manuskript zu verbessern. Unsere Forschung stützt sich auf ein Programm Grant und Kameradschaft, AAH von den National Health und Medical Research Council und eine Übersetzung vom Wellcome Trust zu gewähren. PAR ist ein Empfänger von einem australischen Regierung Training Programm Forschungsstipendium.

Materials

Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/
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Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).
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