샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석
Summary
이 프로토콜에서 zebrafish 태아, 애벌레, 전체 transcriptome 분석에 대 한 접근을 제공 하거나 셀을 정렬 합니다. 우리는 RNA의 격리, RNASeq 데이터의 통로 분석 및 유전자 표정 변화의 qRT-PCR 기반 유효성 검사를 포함합니다.
Abstract
글로벌 진 식 변화의 분석 기본 관찰된 phenotypes 소설 경로 식별 하는 데 유용한 도구입니다. Zebrafish는 동물의 많은 수에서 RNA의 분리의 용이성으로 인해 전체 동물 또는 개별 세포 인구에서 전체 transcriptome의 신속한 평가 위한 훌륭한 모델입니다. 여기에서 zebrafish 태아 RNA 시퀀싱 (RNASeq)를 사용 하 여 글로벌 진 식 분석을 위한 프로토콜 제공 됩니다. 우리는 전체 배아 또는 유전자 변형 동물에서 정렬 셀을 사용 하 여 얻은 세포 인구에서 RNA의 준비를 설명 합니다. 또한 RNASeq 데이터 농축된 경로 및 글로벌 유전자 표현 데이터 세트에 유전자 존재론 (가십시오) 용어를의 분석에 대 한 접근 방식을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 유전자 식 변경 정량 역전사 PCR (qRT-PCR)를 사용 하 여 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 이러한 프로토콜 사용할 수 있습니다 제어의 비교 분석 및 실험 세트 zebrafish의 소설 유전자 표현 변화를 식별 하 고 분자 통찰력의 고기를 제공 합니다.
Introduction
글로벌 유전자 발현의 비교 분석 관찰된 고기에 기여 하는 새로운 유전자를 식별 하는 중요 한 도구입니다. 이러한 분석 일반적으로 사본 풍부 실험 사이 비교의 양적 평가에 의존 및 샘플을 제어. QRT-PCR 등 타겟된 방법을 상대적으로 신속 하 고 정확한 단일 유전자 식 변경의 조사에 대 한 있습니다. RNA 시퀀싱 (RNASeq) 샘플, 그건 지금 그런 수사에 대 한 표준 실험 시스템 사이의 유전자 발현에 중요 한 변화를 식별 하는 광범위 한, 가설-무료 접근을 제공 합니다.
Zebrafish는 많은 질병 분야에 걸쳐 눈에 띄는 모델로 떠오르고 있다. 원래 발달 생물학 연구, 그들의 높은 통치 및 유지 보수, 상대적으로 낮은 비용 때문에 그들의 유틸리티에 대 한 개발 zebrafish의 실험적인 사용 진화 했다 다양 한로 서 뿐만 아니라 성인 단계 배아에서 고기를 포함 한 다양 한 분자의1,2,3분석 실험. 사실, 이러한 장점을 분자 기계 연구 급속 한 만들고 많은 양의 자료를 습득의 용이성 때문에 비용 효율적인 생활의 모든 단계에서 유전과 환경 조작의 용이성과 결합. 또한, zebrafish 태아 그리고 애벌레의 투명 한 자연 세포-조직-특정 유전자 변형 기자 라인 개별 셀 인구4의 비보에 시각화 수 있도록 생성에 대 한 이상적인 게. 같은 라인의 착취 리포터 유전자 발현에 따라 특정 격리 된 세포 유형에서 글로벌 유전자 표정 분석을 허용 합니다.
여기 선물이 zebrafish 태아의 문화 후 RNASeq를 사용 하 여 글로벌 유전자 표정 분석에 대 한 포괄적인 프로토콜. Morpholino (모)를 포함 하 여 유전 실험 조작-기반된 변이 유전자 최저 또는 CRISPR 중재 게놈 편집, 제시 된 다른5,,67. 우리는 따라서 전체 배아에서 RNA의 격리에 대 한 자세한 프로토콜에 초점 또는 경로 도구와 유전자 존재론 (가십시오) 용어를 사용 하 여 RNASeq 결과의 간단한 계산 분석 뒤 유전자 변형 기자 표현 셀 정렬. 마지막으로, 우리 정량 역전사 PCR (qRT-PCR)에 의해 유전자 표현 변경의 유효성 검사에 대 한 전략을 포함 했다. 이러한 프로토콜 zebrafish 태아 다양 한 실험 조건, 유전 돌연변이 또는 환경 조건 비교를 포함 하 여 대상에 적용 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 설명 하는 접근의 전체 또는 특정 정렬된 셀 인구 transcriptome 수준 분석에 대 한 상대적으로 신속 하 고 비용 효과적인 전략을 제공 합니다. Zebrafish는 편리 함과 소재, 유전 구현의 용이성 또는 환경 실험 조건, 및 큰의 가용성을 시작 하는 많은 양의 생성 속도 때문에 연구의이 유형에 대 한 유리한 모델을 제공 합니다. 셀 형 구체적이 고 조직 특정 인구의 격리를 허용 하는 유전자 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.), 및 T32DK098107에 의해 지원 되었다 (T.L.H. 및 J.E.N.).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
References
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