Técnica mínimamente invasiva constricción aórtica transversal en ratones para la inducción de la hipertrofia Ventricular izquierda
Summary
El objetivo de este protocolo es describir paso a paso la técnica de invasión mínima constricción aórtica transversal (TAC) en ratones. Por la eliminación de la intubación y la ventilación que son obligatorios para el procedimiento estándar utilizado, mínimamente invasiva TAC simplifica el procedimiento operativo y reduce el esfuerzo puesto en el animal.
Abstract
Constricción aórtica transversal (TAC) en ratones es una de las técnicas quirúrgicas más utilizadas para la investigación experimental de la presión inducida por sobrecarga izquierda hipertrofia ventricular (HVI) y su progresión a insuficiencia cardíaca. En la mayoría de las investigaciones divulgadas, este procedimiento se realiza con intubación y la ventilación del animal que lo hace exigente y requiere mucho tiempo y agrega a la carga quirúrgica al animal. El objetivo de este protocolo es describir una técnica simplificada de TAC mínimamente invasiva sin intubación y la ventilación de los ratones. Pasos críticos de la técnica se acentúan con el fin de lograr la baja mortalidad y alta eficiencia en la inducción de HVI.
Ratones C57BL/6 machos (10 semanas de edad, 25-30 g, n = 60) fueron anestesiados con una sola inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina y xilacina. Una respiración espontánea animales tras una esternotomía parcial superior 3-4 mm, un segmento de sutura de seda 6/0 a través de los ojos de una ayuda de ligadura se pasó bajo el arco aórtico y atado sobre una aguja calibre 27 blunted. Animales funcionan Sham experimentaron la misma preparación quirúrgica pero sin constricción aórtica. La eficacia del procedimiento en la inducción de HVI es atestiguada por un aumento significativo en la proporción de corazón y cuerpo. Esta relación se obtiene en los días 3, 7, 14 y 28 después de la cirugía (n = 6-10 en cada grupo y cada punto del tiempo). Usando nuestra técnica, la HVI se observa en TAC comparado con animales de la farsa del día 7 hasta el día 28. Operativa y tardía (más de 28 días) mortalidad es muy bajas en el 1,7%.
En conclusión, nuestra técnica rentable de mínimamente invasiva TAC en ratones lleva muy baja mortalidad operativas y postoperatorias y es altamente eficaz en la inducción de HVI. Se simplifica el procedimiento operativo y reduce el esfuerzo puesto en el animal. Se pueden realizar fácilmente siguiendo los pasos críticos descritos en este protocolo.
Introduction
En los últimos años, se ha realizado el estudio de la insuficiencia cardíaca en modelos de animales viables1. En comparación con grandes modelos animales de insuficiencia cardíaca, modelos animales pequeños tienen numerosas ventajas potenciales. Al lado de bajos costos de mantenimiento y vivienda, modelos animales pequeños son accesibles a los investigadores más debido a la menos compleja de las instalaciones necesarias2.
Modelos de ratón insuficiencia cardiaca ofrecen muchas de las mismas ventajas que los modelos de rata. Además vivienda a menor costo3, modelos de ratón se benefician de la disponibilidad de relevantes transgénicas y knockout (KO) cepas. La posibilidad de células tipo-específica, inducible por KO o estrategias transgénicas hacen el ratón una valiosa herramienta para el estudio de la patogenia de la insuficiencia cardíaca y para tratar de identificar nuevos regímenes terapéuticos3.
Entre el ratón actualmente utilizaron4modelos de insuficiencia cardíaca, constricción aórtica transversal (TAC) que primero fue descrita por Rockman5 es el modelo preferido para generar hipertrofia ventricular izquierda (HVI) inducida por sobrecarga de presión1 , 3. la mayor ventaja de este modelo es la capacidad para permitir la estratificación de la HVI2, aunque ventrículo izquierdo remodelado en respuesta a la TAC es variable entre las cepas de ratón diferente. En particular, ratones C57BL/6 desarrollan rápida dilatación del LV después de TAC que no puede ocurrir con otras cepas4,6,7.
El inicio repentino de hipertensión conseguido TAC causas un aproximadamente 50% aumento en masa del VI en 2 semanas, que permite examinar rápidamente la actividad de intervenciones farmacológicas o moleculares con el objetivo de modular el desarrollo de HVI4. La inducción aguda de la hipertensión severa por TAC no exactamente reproducir la hipertrofia ventricular izquierda progresiva y remodelación observado en el ajuste clínico de la estenosis aórtica o hipertensión arterial. Sin embargo, este modelo es utilizado por muchos investigadores para identificar y modificar nuevas dianas terapéuticas en la insuficiencia cardíaca4.
Realización de TAC en los ratones requiere mayor experiencia quirúrgica que requiere de otras técnicas utilizadas para inducir HVI y posterior insuficiencia cardiaca2. Mayoría de los autores realiza este procedimiento de intubación y ventilación del animal2,8, que hace este procedimiento más exigente y requiere mucho tiempo y agrega a la carga quirúrgica para el animal. Sólo algunos investigadores han utilizado mínimamente invasiva TAC en su estudio con breve referencia al procedimiento quirúrgico9,10,11.
El objetivo de este protocolo es describir paso a paso una técnica mínimamente invasiva constricción aórtica transversal en ratones, destacando las etapas críticas del procedimiento simplificada y fácil de usar. Siguiendo estos pasos, uno fácilmente puede realizar esta técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de este protocolo es presentar una ilustración paso a paso de la técnica quirúrgica para la constricción aórtica transversal mínimamente invasiva en ratones. Descripción técnica detallada de la constricción aórtica transversal en ratones ha sido reportado por otros autores2,8. Sin embargo, estos investigadores realizan la cirugía después de la intubación y la ventilación de los animales. El uso de un paso adicional de intubación ventila…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una subvención (N ° 32016) de la Fundación Cardiovascular suizo a RT.
Materials
| Surgical microscope | Olympus | SZX2-TR30 | |
| Razor | Rowenta | Nomad TN3650FO | |
| Sutures: | |||
| Polypropylene 7/0 | Ethicon | BV-1X | |
| Polypropylene 6/0 | BBraun | C0862061 | |
| Silk 6/0 ligature | FST | 18020-60 | |
| Polypropylene 4/0 | Ethicon | 8683 | |
| Polypropylene 5/0 | Ethicon | Z303 | |
| Drugs: | |||
| Ketamin | Merial | Imalgène 1000, LBM154AD | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2%, KP09PPC | |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic, 072013 | |
| Instruments: | |||
| Bone nippers | Fine Surgical Tools | 16101-10 | |
| Ligation aid | Fine Surgical Tools | 18062-12 | |
| Tying forceps | Fine Surgical Tools | 18026-10 | |
| Needle holder Crile-Wood | Fine Surgical Tools | 12003-15 | |
| Microsurgery forceps | Fine Surgical Tools | 11003-12 | |
| Microsurgery forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Tissue forceps | Fine Surgical Tools | 11021-12 | |
| Microsurgery needle holder | Fine Surgical Tools | 12076-12 | |
| Microsurgery scissors | Fine Surgical Tools | 91501-09 | |
| Mayo scissors | Fine Surgical Tools | 14511-15 | |
| 11-blade knife | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| RNA extraction and qPCR: | |||
| TriReagent | Euromedex | TR-118-200 | |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74704 | |
| Qubit Fluorimetric RNA assay | Fisher Scientific | 10034622 | |
| RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
| High Capacity cDNA kit | Fisher Scientific | 10400745 | |
| Taqman Master Mix | Fisher Scientific | 10157154 | |
| Taqman BNP primers | Fisher Scientific | Mm01255770_g1 | |
| Taqman ANP primers | Fisher Scientific | Mm01255747_g1 | |
| Taqman ACE primers | Fisher Scientific | Mm00802048_m1 | |
| Taqman Col1a1 primers | Fisher Scientific | Mm00801666_g1 | |
| Taqman TGFb primers | Fisher Scientific | Mm01178820_m1 | |
| Taqman Gapdh primers | Fisher Scientific | Mm99999915_g1 | |
| ABIPrism Thermocycler | Applied Biosystems | 7000 | |
| Software: | |||
| GraphPad Prism | GraphPad | Prism 7 | |
| Animal food | |||
| Complete diet for adult rats/mice | Safe | UB220610R |
References
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