הכנת הדוגמא לניתוח Endopeptidomic ב אנושי נוזל מוחי שדרתי
Summary
שיטה לניתוח spectrometric המוני של פפטידים אנדוגני האנושי נוזל מוחי שדרתי (CSF) מוצג. על ידי העסקת משקל מולקולרי ניתוק סינון, fractionation קדם כרומטוגרפי, המוני spectrometric ניתוח ושילוב עוקבות של פפטיד זיהוי אסטרטגיות, ניתן היה להרחיב את peptidome CSF ידוע כמעט כוחנו לעומת על מחקרים קודמים.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר שיטה שפותחה כדי לזהות פפטידים אנדוגני האנושי נוזל מוחי שדרתי (CSF). למטרה זו, שיטה שפותחה בעבר מבוסס על סינון ניתוק (MWCO) משקל מולקולרי, ניתוח spectrometric המוני היה בשילוב עם שלב טרום fractionation HPLC מנותק גבוהה pH שלב הפוכה.
הפרשת לתוך CSF הוא השביל הראשי הסרה של מולקולות לשפוך על ידי תאים של מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, תהליכים רבים במערכת העצבים המרכזית משתקפים CSF, טיוח זה נוזל אבחון יקר. CSF יש קומפוזיציה מורכב, המכיל חלבונים המתפרסים על פני טווח הריכוז של 8-9 סדרי גודל. מלבד חלבונים, מחקרים קודמים הדגימו גם הנוכחות של מספר גדול של פפטידים אנדוגני. בעוד פחות בהרחבה למד מאשר חלבונים, אלה בחובו גם עניין פוטנציאלי כמו סמנים ביולוגיים.
פפטידים אנדוגני הופרדו מן התוכן חלבון נוזל מוחי-שדרתי דרך סינון MWCO. על-ידי הסרת רוב תכולת החלבון של המדגם, זה אפשרי להגדיל את האחסון מדגם למד, ובכך גם את הסכום הכולל של פפטידים אנדוגני. המורכבות של התערובת פפטיד בפילטר קיבל פניות כולל שלב הפוכה (RP) HPLC fractionation שלפני שלב ב- pH בסיסי לפני ניתוח LC-MS. Fractionation היה בשילוב עם ערכת שרשור פשוט שבו היו שברים 60 איחדו לתוך 12, ניתוח זמן הצריכה ובכך יופחת תוך הימנעות עדיין במידה רבה • תנאי שיתוף.
זיהוי אוטומטי פפטיד בוצעה באמצעות שלושה שונים אלקטרופיזיולוגיה זיהוי תוכנות ו לאחר מכן ומשלב את התוצאות. תוכניות השונות היו משלימים ולא דומה עם פחות מ 15% ההזדהויות חפפו בין שלוש.
Introduction
סמנים ביולוגיים בנוזל מוחי שדרתי (CSF) הם בחקר כעת לתוך הפרעות ניווניות. של מחלת האלצהיימר, הפרעה ניווניות הנפוץ ביותר, משפיע על מעל ל-60 מיליון אנשים ברחבי העולם1,2, שלישיה סמן המורכב של פפטיד בטא עמילואיד, ייצוב ליבות microtubule חלבון טאו, ו- a phosphorylated טאו טופס, ניתן לזהות את המחלה עם רגישות גבוהה, כבר נכלל קריטריונים אבחון מחקר3. מחלות ניווניות אחרות, כגון מחלת פרקינסון, טרשת נפוצה, פרוטיאומיה מבנית מחקרים זיהו סמן מועמדים רבים, שחלקם נמצאים כעת תחת הערכה מחקרים קליניים4,5 ,6.
לצד חלבונים, CSF מכיל גם שפע של פפטידים אנדוגני7,8,9,10,11,12. המהוות מוצרים המחשוף של חלבונים רבים נגזר המוח, פפטידים אלה מייצגים גם מקור פוטנציאלי חשוב של סמנים למחלת. כדי להגדיל את המלאי של פפטידים אנדוגני מזוהה ב- CSF אנושי ולאפשר CSF ניתוחים endopeptidomic במחקרים קליניים, פותחה שיטה עבור הכנת הדוגמא וניתוח LC-MS (ערכה פרוטוקול קצר כבר נכלל באיור 1 ). היישום של שיטה זו של מחקר שנערך לאחרונה הביא הזיהוי של פפטידים CSF אנדוגני כמעט 16,400 במאגר דגימות נוזל מוחי-שדרתי מאנשים שונים שאינם ספציפיים אבחון, מרחיבה endopeptidome CSF ידוע ten-fold13. השיטה לחלופין ניתן בשילוב עם הגישה isobaric תוויות על כימות.
הכנת הדוגמא
המקור העיקרי של מסת חלבון ב- CSF הוא המרכיבים פלזמה (למשל אלבומין ו- immunoglobulins) שהעביר את הדם במוח מכשול14,15. שפע גבוהה שלהם הסלים זיהוי הדגימה נמוך-בשפע, המוח-derived רכיבים. פפטידים אנדוגני ניתן להפריד בקלות מן החלבונים גבוהה-בשפע, ובכך לאפשר נפח גדול יותר באופן משמעותי של CSF תמצית פפטיד שישמש עבור ניתוח LC-MS, ובכך מאפשר זיהוי של פפטידים התחתונה-בשפע.
פרוטוקול המובאת כאן, משקל מולקולרי סינון ניתוק (MWCO) שימשה להפריד את פפטידים CSF השבר חלבון; שיטה בה נעשה שימוש בכמה הקודם מחקרים8,9,10,11,12,16. השלב הסינון בעקבות שלב טרום fractionation RP HPLC מנותק לבצע מעבר הדרגתי שלב ניידות גבוהה pH. על ידי ביצוע שני צעדים RP HPLC, במשולב עם pH להיות ההבחנה העיקרית, ההבדל סלקטיביות בין שני השלבים נובעת בעיקר השמירה פפטיד שינו בעקבות הברית תשלום פפטיד שונים. היישום של פפטיד גבוהה pH fractionation מראש לפני LC-MS בתנאים חומציים הוכח יעיל בהגדלת פפטיד זיהוי17,18, ולהיות אפילו מעולה למטרה זו בביולוגיים מורכבים לעומת יותר ההפרדה אורתוגונלית מצבי19, כגון חתול חזק-ion exchange (SCX) ו- RP20דוגמאות. כדי לקצר את זמן הניתוח, שימש ערכת שרשור, צירוף כל 12th שבר (למשל, שברים 1, 13, 25, 37 ו- 49), אשר בשל הכוח פתרון גבוהה של RP HPLC עדיין במידה רבה להימנע שיתוף • תנאי של פפטידים מ שונה שברים ב- LC-MS שלב20,21.
זיהוי פפטיד
זיהוי פפטיד במחקרים peptidomic שונה מזו של מחקרים פרוטיאומיה מבנית בכך בלי מחשוף אנזים ניתן לציין את חיפוש מסד הנתונים, כתוצאה מכך, זיהוי המחירים הם בדרך כלל נמוך11. מחקר האחרונות13 הראה כי ביותר במחירים זיהוי פפטידים אנדוגני שהושג עם Sequest, הקמע שופרו באופן משמעותי כאשר ברירת המחדל הבקיע אלגוריתם של התוכנה המתאימים שונתה באמצעות החריצים מסתגלת אלגוריתם תאמינו, המציין כי אלגוריתמים הבקיע אופטימלית אנדוגני פפטידים שונים של פפטידים tryptic13. באותו מחקר, זיהוי מבוסס על רצף דה נובו פפטיד אוטומטית באמצעות תוכנה פסגות (BSI) נמצאה להיות משלים מנועי חיפוש מבוססי טביעת אצבע של יון קטע שני, וכתוצאה מכך ערכה גדול יותר באופן משמעותי של מזוהה פפטידים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המבוא של גבוהה pH RP HPLC fractionation שלפני שלב לפרוטוקול בעבר מפותח עבור שחזור של פפטידים אנדוגני לפי משקל מולקולרי אולטראפילטרציה11 מדגם היחסי מורכבות מופחתת, ובכך למעשה איפשר עבור גדול 5 פי נפח דגימה שילמדו. זה, בתורו, גדל הריכוז של המשנה של פפטידים נוכח כל שבר, ובכך לשפר את הסיכויים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודות Tanveer Batth ועמיתיו לקבלת ייעוץ בנושא קביעת שיטת fractionation מראש.
עבודה זו נתמכה על ידי מימון של המועצה למחקר השבדי, את Wallström ואת Sjöblom קרן, את האקדח, ברטיל Stohne קרן Stiftelse, קרן Bergwall מגנוס, קרן Åhlén, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen לפרטים שלך Tjänarinnor גמלא, קנוט, אליס ולנברג קרן, Frimurarestiftelsen ו ג ינג-Västra Götalandsregionen.
הנמענים העיקרי של המימון לפרויקט זה היו מנהלים Blennow, הנריק Zetterberg, יוהן Gobom.
Materials
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer’s disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer’s disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer’s disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
