Summary

Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt

Published: November 23, 2017
doi:

Summary

Bu iletişim kuralı olarak bir düzeni kanser hücre satırları ve sonraki kullanımı, işlevsel bir Tet-ON sistemi kurmak için özellikle monosit/makrofajlar tümör microenvironment için işe alım içinde tümör hücre kaynaklı proteinlerin rolü eğitimi için hizmet vermektedir.

Abstract

siRNA ve gen ifadesinin düzenlenmesine (KD) yöntemleri yıkmak shRNA-aracılı protein ve gen işlevini anlamak için çok değerli araçlardır. Ancak, KD ilgi proteinin hücre öldürücü etkisi veya KD beklenen etkisini durumda Saat-bağımlı, koşulsuz KD yöntemleri uygun değildir. Koşullu sistemleri bu gibi durumlarda en uygun ve çok ilgi konusu olmuştur. Bunlar Ecdysone-indüklenebilir overexpression sistemleri, sitokrom P-450 indüksiyon sistemi1, ve tetrasiklin gen ifade sistemleri düzenlenir.

Düzenlenmiş tetrasiklin gen ifade sistem indüksiyon shRNA ifade tetrasiklin huzurunda tarafından protein ifade üzerinde ters çevrilebilir kontrol sağlar. Bu protokol için biz gen ekspresyonu koşullu düzenlenmesi için insan kanser hücre hatlarında fonksiyonel Tet-ON sistemiyle bir deneysel tasarım mevcut. Sonra tümör hücre-monosit etkileşim çalışma programında küçük bir sistem kullanımını göstermektedir.

Introduction

İlişkili tümör makrofajlar (TAMs) teşvik ederek tümör gelişmeye katkıda tümör büyüme, metastaz ve bağışıklık yanıtı2düzenleyen. Kanser tümör sızmak ve pro-tumorigenic TAMs3ayırt askere inflamatuar monosit hücreleri. TAMs ile tümör infiltrasyonu zavallı klinik sonuçlar ile karşılıklı olarak ilişkilendirir ve makrofajlar4,5immünsüpresif rolüne bağlı. Ancak, makrofajlar tümöre alımı mekanizmaları değil de incelenmiştir ve ilgili yollar daha iyi bir anlayış daha fazla alan ve umut verici tedavilerin ilerlemesi için çok önemlidir. Bir tümör hücreleri ve tümör microenvironment (TME) normal hücreleri arasındaki etkileşimler eğitim sorunları karmaşıklığına mekanizmaları ve hücreleri crosstalk diseksiyon izin vitro yaklaşımlar gerektiren yer var. Burada bir kanser hücre kaynaklı etkisini parakrin, salgılanan protein geçiş makrofajlar, vitrogibi diğer hücre türleri üzerinde çalışmaya uygulanan çok yönlü bir metodoloji mevcut. ShRNA karşı bir kanser hücre kaynaklı protein monosit işe dahil ifade tetrasiklin indüklenebilir düzenleyicinin kontrolü altında nerede bir sistemi kullanarak, monosit salgılanan protein parakrin etkisi quantitated. Bu protokol için düzenlenmiş vektör sunulan tetrasiklin içine shRNA dizileri klonlama istikrarlı kanser hücre hatları nesil tarafından takip. Ayrıca, birincil insan monosit ve Boyden odası tahlil arıtma monosit geçirilmesi üzerinde bir kanser hücresi elde edilen protein parakrin etkisini analiz için kullanılır.

Genlerin kodlama protein downregülasyon sınırlamalar rağmen kullanımı olmadan siRNA ve shRNA teknikleri ile yaygın olarak uygulanır. Uzun süreli knock-down (KD) genlerin deneysel sonuçlarla müdahale hücre ikincil adaptif yanıt temin. Gen ifadesinin üzerinde geçici kontrol eksikliği zamana veya rol bir proteinin hücre hayatta kalmak için çok önemli bir protein dinamik rolü çalışmaya zor yapar. Bu sorun, sadece tümör kurulduktan sonra bir protein tümör gelişimi ve ilerlemesi rolü downregülasyon ifade ilgi proteinin nerede gerektirebilir vivo içinde ayarları’nda, özellikle önemlidir. Koşullu KD çok erken bir öldürücü etkisi KD, hücrelerde ve koşulsuz KD içinde tümör geliştirme eksikliği neden olabilir ederken rol protein analizi farklı aşamalarında tümör büyüme, içinde etkinleştirmek için önleme avantajına sahiptir.

Koşullu KD sistemleri bir dizi istikrarlı KD sınırlamaları gidermek üzere geliştirilmiştir. Koşullu gen ifade sistemleri Ecdysone indüklenebilir overexpression sistemleri, sitokrom P-450 indüksiyon sistemi1, ve tetrasiklin gen ifade sistemleri düzenlenir. Tetrasiklin düzenlenir gen ifade sistemleri shRNA antibiyotik tetrasiklin (veya onun daha istikrarlı analog – Doksisiklin) eklenmesi üzerine ifade üzerinde denetim sağlar. Tet-ON sistemlerinde shRNA ifade tetrasiklin/Doksisiklin bir gen ekspresyonu KD, sonuçlanan huzurunda indüklenen Tet-OFF sistemlerinde iken, shRNA ifade gen ifadesinde kaynaklanan tetrasiklin huzurunda bastırılır. Tetrasiklin-indüklenebilir sistem yokluğunda Doksisiklin – sözde leakiness6,7, shRNA ifade daha önce bildirilen düşük seviyelerde dezavantajıdır. Tet-ON sistem burada, yapısal ifade tetrasiklin önleyici (tetra) protein Tet-yanıt veren öğe (TRE) sıra faiz shRNA organizatörü bölgedir H1 içinde bağlama tetrasiklin, yönetim anlatılan bastırılmış. ShRNA ifadesi ve çeviri tetrasiklin bağlı şekilde8,9ilgi protein inhibisyonu sonuçlanır.

Eşzamanlı knock-in sırası TATA kutusu ve proksimal sıra öğesi (PSE) arasında arasında TATA kutusu ve transkripsiyon başlamadan Chan ve arktarafından geliştirilen site TetO, diğer kullanılabilir Tet-ON sistemleri içerir. 10 bu toksik doz tetrasiklin shRNA ifade, ancak, Sigara kaynaklı bir devlet altında düzenleyen shRNA seviyeleri düşük daha az ifade gereklidir. Temel Krüppel ilişkili kutusu (KRAB) Tet-ON sistem11 KRAB, konular genlerin transkripsiyon bastırma KRAB bağlama siteye 3 kb aralığı içinde yer alan bir çinko parmak protein içerir. Chimeric protein tTRKRAB TetO için bağlayabilirsiniz, ve büyük-yelpazesine nedeniyle DNA kontrol edilebilir, TetO değil transkripsiyon arasında sınırlı olmak site ve düzenleyici başlangıç ve düzenleyici faaliyete düşük etkisi. Sigara kaynaklı durumu altında bu kontrol edilebilir RNA müdahale sistemi shRNA11,12Sızan ifade alt düzey göster rapor edilmiştir; Ancak, bir sıralı, iki-vektör klonlama yaklaşım gerektirir. İle karşılaştırıldığında daha önce geliştirilen koşullu KD sistemleri Ecdysone indüklenebilir overexpression sistemi veya sitokrom P-450 indüksiyon sistemi gibi tetrasiklin düzenlenir sistem sağlamlık ve reversibility bir avantaja sahiptir ve bu nedenle En iyi sistem13rutin olarak kullanılan. Bu protokol için kullanılan sistem gibi yalındır, tek vektör klonlama, birden fazla klon, hızlı üretimi izin gerektirir ve leakiness içinde çok az düzeyde sergileyen çift TetO çakma sistemi ve KRAB Tet-ON sistem üzerinden avantajı vardır Doksisiklin yokluğu.

TME kanseri gelişimi için önemlidir. Tümör büyümesini kolaylaştırmak için kanser hücrelerinin inflamatuar monosit kemotaktik protein salgılayan tarafından işe almak. İşe monosit tümör sızmak ve tümör büyümesini ve metastaz katkıda pro tumorigenic TAMs içine ayırt etmek. Vitro çalışmalar bağışıklık hücre alımı geçiş deneyleri kullanmak, Boyden ile14,15,16,17odası tahlil yaygın olarak kullanılır. Bu tahlil, chemoattractant protein kaynağı, örneğin, kanser hücrelerini veya saf protein alt Kamara içinde yer alıyor. Bağışıklık hücreleri geçirgen membran üzerinden alt bölme ile ayrılmış üst odası yer alır. Doğru chemoattractant, ve bu membran alt tarafında bulunan artan Degrade geçiş hücreleri lekeli ve mikroskop altında sayılır. Burada plazminojen aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1) chemoattractant fonksiyonu monosit üzerinde nerede ifade PAI-1 Doksisiklin ek tarafından düzenlenmiştir istikrarlı, indüklenebilir kanser hücre hatları oluşturarak test ediyoruz. İnsan birincil monosit Boyden odası geçiş assay olarak PAI-1 rolde monosit geçiş değerlendirmek için kullanıyoruz. İnsan birincil monosit ve THP1 gibi yaygın olarak kullanılan Monositik hücre hatları arasındaki farklılıkları bildirilmiştir ve farklı sitokin ifade desenleri18içerir; Örneğin, 5-10 kat artış TNF-α ifade düzeylerinde THP1 hücreleri tarafından insan monosit19‘ a karşılaştırılır. THP1 hücreleri insan lösemi Monositik hücrelerden türetilir, kolay korumak ve 19-50 h20saat iki katına ortalama ile çoğalırlar. Tam tersine, insan monosit yokluğunda büyüme faktörleri, kısa bir ömrü ile karakterizedir. Monosit bireyler arasında ve arıtma yöntemine bağlı olarak değişkenlik adil bir miktar oluşur bağış, kandan arındırılmış bu yana diğer hücre tipleri ile kontaminasyon oluşabilir. Bununla birlikte, birincil monosit ilgilidir ve kullanın veya birincil monosit Biyolojik araştırma19‘ kullanarak Monositik hücre hatları ile elde edilen sonuçları onaylamak için tavsiye edilir. Burada insan birincil monosit periferik kandan arınma için bir protokol açıklayın. Monosit arınma alternatif yöntemleri yoğunluk gradient ve yapışma protokolleri ve iki adım prosedürü Ficoll-Hypaque bir Percoll degrade21tarafından takip tek degradelerle içerir. Bu yöntemleri aralıkların % 70-90 arasında elde edilen monosit nüfus saflığı. Burada açıklanan yöntemi ile negatif bağışıklık seçimi22 takip yoğunluğu degradesi kullanan ve antikorlar ile doğrudan temas olmadan insan monosit arıtma böylece yanlışlıkla onların harekete geçirmek kaçınarak ve sonuçlanan sağlar bir > % 95 monosit saf nüfusu.

Burada sunulan Protokolü gen ekspresyonu KD insan kanser hücre hatlarında için işlevsel bir Tet-ON sistemi oluşturmak için kanser kaynaklı salgılanan protein PAI-1 monosit chemoattractant etkisini incelemek için kullanılır. PAI-1 tümörler çeşitli tarafından overexpressed ve onun ifade paradoksal zavallı klinik sonuç23,24ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. PAI-1 pro-tumorigenic rolü, pro-anjiogenik bir sonucudur ve anti-apoptotik25,26çalışır. PAI-1 makrofajlar iltihap27sitesine istihdamı teşvik ederek iltihap için katkıda bulunmak için gösterilmiştir. PAI-1 düz kas cellmigration28,29 teşvik etmelerini ve Mac-1 bağımlı makrofaj geçiş30‘ gösterildi. PAI-1 overexpression zamanda ham 264.7 makrofajlar işe alım B16F10 Melanom tümörler31içine önemli ölçüde artırmak için gösterilmiştir. Ancak, PAI-1 rolde TAM geçiş ayrıntılı olarak araştırmış değil. Olup PAI-1 monosit kanser hücrelerine çeken soruyu cevaplamak için açıklanan protokolünü kullanır. Bu metodoloji diseksiyon tümör ve TME arasında çapraz karışma kanser hücrelerinde salgılanan protein susturmak ve TME bileşenlerini analiz sağlar.

Protocol

İnsan monosit sağlıklı gönüllülerden elde kullandığı protokolü bölümünde çocukların hastane Los Angeles insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler ve insan malzeme altında Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylandı Protokol numarası: CCI 08-00208. 1. kanser hücre hatları ile tetrasiklin düzenlenir shRNA ifade hazırlanması ShRNA PAI-1 Tet-pLKO-puro vektör içine klonlama 8 , <sup class="xref…

Representative Results

Üç shRNA dizileri en verimli KD, PAI-1 için test edildi. Bunun için yukarıda açıklanan protokol sonrası Tet-pLKO-puro ifade vektör içine shRNA dizileri PAI-1 ve şifreli (Tablo 1) karşı klonlanmış. HT-1080 Fibrosarkom hücre kültürünü stabil oluşturulan yapıları ile transfected ve hücreleri 3 gün boyunca Doksisiklin ile tedavi edildi. PAI-1 ifade tarafından Western Blot ()şekil 2Adoğrulandı) ve PAI-…

Discussion

Hücre tiplerinin çeşitli oluşur, TME kanseri gelişimi için çok önemlidir. Optimal büyüme koşullarını tespit etmek için kanser hücrelerinin monosit kemotaktik faktör salgılanmasını aracılığıyla çekmek. Burada monosit işe alım mekanizması tümör hücreleri vitrotarafından eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu amaçla, bir indüklenebilir gen ifade sistem, arıtma birincil insan monosit ve bir geçiş yöntemi, Boyden odası tahlil bir örnek olarak kullanılır.

<p class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Jacqueline Rosenberg el yazması proofreading için kabul etmek istiyorum. Bu eser bize Bölümü Sağlık ve insan Hizmetleri/Ulusal Sağlık Enstitüleri YA DeClerck için hibe ile tarafından desteklenmiştir (5R01 CA 129377 vermek) ve TJ Martell Vakfı. MH Kubala Saban Araştırma Enstitüsü Çocuk Hastanesi Los Angeles adlı bir araştırma kariyer geliştirme Fellowship Ödülü alıcı olduğunu.

Materials

Tet-pLKO-puro lentiviral vector Addgene 21915
FBS (Tetracycline-free) Omega Scientific FB-15
Histopaque Sigma 10771-500ML
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit StemCell 19059
EasySep Magnet StemCell 18002
EcoRI HF NEB R3101S
AgeI HF NEB R3552S
Cut Smart buffer NEB B7200S
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System PROMEGA A9281
psPAX vector Addgene 12260
pMD2.G vector Addgene 12259
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher Scientific C737303
Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain Protocol 123-869
HEK293 cells ATCC CRL-1573
PBS Corning 21-031-CV
XhoI restriction enzyme NEB R0146S
Ligase NEB M0202S
Ligase buffer NEB M0202S
EDTA 0.5 M solution Thermo Fisher Scientific R1021
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
The Big Easy" EasySep Magnet Stem Cell 18001
0.1% Poly-L-Lysine solution Sigma-Aldrich P8920
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S7670
Sodium butyrate Sigma-Aldrich B5887
0.45 μM syringe filters VWR International 28145-479
NaOH Sigma-Aldrich S5881-500g
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Invitrogen 15504-020
Sodium Chloride(NaCl) Sigma-Aldrich S7653-5 kg
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266-100g
dithioerythritol (DTE) Sigma-Aldrich B8255-5g
ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich 792780
tryptone Amresco J859-500g
yeast extract Fluka 70161-500g
Bacto agar BD 214010
ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5g
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) Corning 10-013-CV
phosphate-buffered saline (PBS) Corning 21-031-CV
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
puromycin Sigma-Aldrich P9620
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Corning 10-040-CV
0.5 M EDTA pH 8.0 Thermo Fisher Scientific R1021
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane Becton Dickinson 353097
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
Cotton-Tipped Applicator  Medline MDS202000
Protocol Hema 3 STAT pack  Fisher Scientific Company 123-869
Resolve Immersion Oil, High Viscosity Richard Allan Scientific M4004
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122

References

  1. Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
  2. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  3. Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
  4. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
  7. Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
  8. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  9. Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
  10. Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
  11. Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
  12. Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
  13. Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
  14. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  15. Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
  16. Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
  17. Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
  18. Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
  19. Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
  20. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  21. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  22. Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
  23. Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
  24. Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
  25. Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
  26. Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
  27. Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
  28. Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
  29. Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
  30. Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
  31. Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
  32. Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
  33. Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
  34. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
  35. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  36. Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).
check_url/cn/56333?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Kubala, M. H., DeClerck, Y. A. Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (129), e56333, doi:10.3791/56333 (2017).

View Video