הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן
Summary
המחקר מדווח על שתי שיטות שונות לניתוח של הפלישה תא והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן, במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ ריפוי פצע וזמינותו. הפרוטוקולים עבור שני ניסויים אלה מתוארים, היתרונות והחסרונות שלהם מושווים.
Abstract
היכולות הפלישה והעברה של תאים סרטניים הם התורמים העיקריים התקדמות סרטן, מופע חוזר. מחקרים רבים בחנו את יכולות העברה ופלישה להבין איך להפיץ תאים סרטניים, במטרה לפתח אסטרטגיות טיפול חדשות. ניתוח של הבסיס תאית ומולקולרית של היכולות הללו הוביל אפיון תא ניידות ואת המאפיינים physicochemical של שלד התא, microenvironment הסלולר. במשך שנים רבות, וזמינותו קאמרית בוידן ואת וזמינותו פצע שריטה כבר הטכניקות רגיל ללמוד תא הפלישה והעברה. עם זאת, אלה שתי טכניקות יש מגבלות. וזמינותו קאמרית בוידן קשה וצורכת זמן, ויש וזמינותו פצע שריטה הפארמצבטית נמוכה. התפתחות הטכנולוגיות המודרניות, במיוחד במיקרוסקופ, הגבירה את הפארמצבטית של פצע שריטה וזמינותו. באמצעות מערכות ניתוח רב-עוצמה, מיקרוסקופ וידאו “בחממה” יכול לשמש כדי לספק וניתוח אוטומטי בזמן אמת של נדידת תאים, הפלישה. מטרת מאמר זה היא לדווח ולהשוות את מבחני שני חקר התא הפלישה והעברה: וזמינותו קאמרית בוידן וטיוטה אופטימיזציה במבחנה וידאו מבוסס-מיקרוסקופ פצע וזמינותו.
Introduction
תא הפלישה והעברה מעורבים להפצת תאים סרטניים, אשר מהווה את הגורם העיקרי של התנגדות טיפול1 והוא יכול להוביל locoregional או הישנות גרורתי לאחר סרטן טיפול2. המעבר אפיתל-mesenchymal (החובשים) הוא התהליך הראשוני של הפלישה-נדידת תאים שבה סרטן תאים להחליף בין אפיתל הפנוטיפ mesenchymal. E-קדהרין הוא סמן חוץ-תאי של פנוטיפ אפיתל3, ביטוי מוגבר של N-קדהרין, vimentin היא תכונה של פנוטיפ mesenchymal4. ההעברה תלויה גם הקיבולת מהותי של תאים סרטניים לפלוש מטריצות (ECM) דרך הפעולה של מטריקס metalloproteases5.
מנגנון ההעברה – הפלישה זה תואר לסרטן במקומות רבים, בפרט סרטן הראש והצוואר6. חוקרים רבים התמקדו תהליכי ההעברה ופלישה כדי להבין טוב יותר כיצד תאים סרטניים להפיץ בתקווה כי הידע הזה יוביל אסטרטגיות טיפול חדשות. זה הכרחי כי מחקרים אלה מבוצעות באמצעות מבחני לשחזור ואמין.
ניתוח במבחנה של תנועתיות התא יכול להיות מאתגר. שפותחה לפני שנים רבות, וזמינותו קאמרית בוידן נחשב להיות הסטנדרט עבור ניתוח הפלישה – הגירה7. עם זאת, זהו זמן רב והוא לעיתים קרובות לא מדויק. בדיקה נוספת היא ריפוי פצע assay8, אשר כרוך ביצוע שריטה על תרבות חד שכבתי תא לכידת תמונות של תא הפלישה והעברה במרווחי זמן קבועים. טכניקה זו ביקורת נרחב בגלל הווריאציות גדול בין התוצאות של שתי בדיקות רצופות. עם זאת, היישום של טכנולוגיות מודרניות, במיוחד במיקרוסקופ, השתפרה את הפארמצבטית של פצע שריטה וזמינותו. מיקרוסקופ וידאו יכול להיות בקלות הציג חממות, ניתן להפיק תמונות בזמן אמת של נדידת תאים. התקנים אלה להקליט נתונים מיקרוסקופיים, מספקים ניתוח אוטומטי של הפצע תא זרימה לאורך זמן. מטרת המאמר היא לתאר וזמינותו קאמרית בוידן ואת וזמינותו פצע שריטה ממוטבת, כדי לדון את היתרונות והחסרונות של כל גישה.
Protocol
Representative Results
Discussion
. מדווחים כאן שתי שיטות שונות ללמוד הפלישה תא את תהליך ההעברה. הניתוח של תהליך זה חשוב להבנת הגורמים המעורבים הישנות גרורתי, אשר יכול להיות מוסבר על ידי תנועתיות מוגברת subpopulation של תאים סרטניים נקרא סרטן בתאי גזע10,11.
הניסוי קאמרית בוידן היא אחת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
טכניקות אלה פותחו עם התמיכה של LabEx הראשוניים (ANR-11-LABX-0063), תוכנית Contrat-הינוממוקם-אזור (CPER) במסגרת מדעי אטואל (CPER 2009-2013), לירית גרנט האינקה-DGOS-4664.
Materials
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
| Wound Maker | Essen Bioscience | 4494 | Store in safe and dry place |
| 96-well ImageLock Plate | Essen Bioscience | 4379 | |
| CoolBox 96F System with CoolSink 96F | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| CoolBox with M30 System | Essen Bioscience | 1500-0078-A00 | |
| Boyden Insert | Dominique Dutcher | 353097 | |
| Boyden Coated Insert | Dominique Dutcher | 354483 | Store at -20 °C |
| Companion 24-well Plate | Dominique Dutcher | 353504 | |
| BD Matrigel standard | BD BioScience | BD 354234 | Store at -20°C. |
| RAL 555 Staining Kit | RAL Diagnostics | 361550 | Store in safe and dry place |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 33511 |
References
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Moncharmont, C., et al. Radiation-enhanced cell migration/invasion process: A review. Crit Rev Oncol Hematol. , (2014).
- Burdsal, C. A., Damsky, C. H., Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at the mammalian primitive streak. Development. 118 (3), 829-844 (1993).
- Chen, C., Zimmermann, M., Tinhofer, I., Kaufmann, A. M., Albers, A. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and cancer stem(-like) cells in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 338 (1), 47-56 (2013).
- Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol. 18 (5), 1135-1149 (2000).
- Smith, A., Teknos, T. N., Pan, Q. Epithelial to mesenchymal transition in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 49 (4), 287-292 (2013).
- Chen, H. -. C. Boyden chamber assay. Meth Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. -. L. Wound-healing assay. Meth Mol Biol. 294, 23-29 (2005).
- Piaton, E., et al. Technical recommendations and best practice guidelines for May-Grünwald-Giemsa staining: literature review and insights from the quality assurance. Ann Path. 35 (4), 294-305 (2015).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: cancer stem cell. Cancer lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Moncharmont, C., et al. Carbon ion irradiation withstands cancer stem cells’ migration/invasion process in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC). Oncotarget. 7 (30), 47738-47749 (2016).
- Gilormini, M., Wozny, A. -. S., Battiston-Montagne, P., Ardail, D., Alphonse, G., Rodriguez-Lafrasse, C. Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics. J Vis Exp: JoVE. (111), (2016).
