Summary

Kitle yalıtım ve Intramolluscan insan kan Fluke Schistosoma Mansoni aşamalarında Vitro ekimi

Published: January 14, 2018
doi:

Summary

Bu makalede büyük ölçekli axenic yalıtım ve insan kan fluke Schistosoma mansoni free-swimming miracidia toplanması için bir protokol ve onların sonraki işlem vitro kültür içine giriş için.

Abstract

İnsan kan flukes, Schistosoma spp., bir salyangoz ara ve memeli son ev sahibi içinde eşeysiz ve cinsel Gelişim aşamaları sırasıyla içeren karmaşık bir yaşam döngüsü var. İzole etmek ve farklı yaşam döngüsü aşamaları vitro kültür koşullar altında sürdürmek yeteneği büyük ölçüde araştırmalar parazit büyüme, gelişme ve ana bilgisayar düzenleyen hücresel, biyokimyasal ve moleküler mekanizmaları kolaylaştırdı etkileşimler. Sistozomyas iletimini eşeysiz üreme ve gelişme salyangoz ana bilgisayar içinde birden çok larva aşamaları gerektirir; Enfektif miracidium, insanlara infektif son cercarial aşaması için birincil ve ikincil sporocysts aracılığıyla. Bu yazıda biz kitle tarama ve izole Schistosoma mansoni miracidia yumurtadan karaciğerleri virüslü fareler ve onların sonraki giriş vitro kültür içine elde edilmesi için adım adım bir protokolü mevcut. Detaylı iletişim kuralı yeni araştırmacılar meşgul ve bu önemli alan paraziti araştırma genişletmek için teşvik edecek öngörülmektedir.

Introduction

İnsan flukes Schistosoma spp. kan, şistozomiyazis, ihmal edilen tropikal bir hastalık bir tahmini 230 milyon kişi dünya çapında1etkileyen etken ajanlardır. En yaygın tür, Schistosoma mansoni, Güney Amerika, Karayipler adalar, Orta Doğu ve alt-Sahra Afrika2coğrafi olarak dağıtılır. S. mansonive diğer schistosomes yaşam döngüsünün bir memeli kesin ana bilgisayar ve zorunlu ara konukçu olarak hizmet tatlı su Biomphalaria cinsi salyangoz içeren karmaşık bir şey.

S. mansoni erkek ve dişi yetişkin bağırsak mukoza küçük venüller içinde teslim olmak embryonated yumurta (ova) sürümü sonuçlanan yaşayan memeli ev sahibi çoğaltmak, posterior Mezenterik damarlarında çiftleri solucan. Yumurta sonra tatili gemi duvarları üzerinden Mukozal doku ile göç ve sonunda nerede dışkı ile hükümsüz intestinal Lümen girin. Ova tatlı su ve free-swimming larva (miracidia) kapağı girdiğinizde, onlar kısa sürede yaşam döngüsünün devam edebilmek için bulaştırmak için uygun bir Biomphalaria salyangoz bulmalısınız. Bu enfeksiyon işlem salyangoz’ın dış gövdesi yüzey aktif penetrasyon ve larva giriş ana bilgisayar takip miracidial eki içerir. Yakında girmesinden sonra miracidium sonraki larva sahne alanı, birincil ya da anne sporocyst’ın yeni dış yüzey (tegument) olacak bir syncytium formlar onun dış siliyer epidermal plakaları döken başlar. Eşeysiz üreme, her birincil sporocyst üretir ve ikinci nesil sporocysts, ikincil olarak adlandırdığı veya sırayla, oluşturmak ve son intramolluscan aşaması, cercaria3 çok sayıda yayın kızı sporocysts bültenleri . Salyangoz ana bilgisayardan kaçış, free-swimming cercariae için bağlama ve doğrudan bir insan veya diğer uygun memeli ana cildin derinlemesine yeteneğine sahiptirler. Yeni ev sahibi girdiği, üzerine cercariae parazit schistosomula Sahne Alanı’na dönüştürmek ve damar sistemi istila. Onlar, buna karşılık, akciğer ve sonra nerede yetişkin solucanlar için olgun, erkek ve dişi çiftleri oluşturmak ve onların yaşam döngüsünü tamamlamak için Mezenterik damarların seyahat hepatik ven göç.

Başarılı intramolluscan veya larva schistosomes gelişimi “Salyangoz aşama” için insan ana bilgisayar ana bilgisayar veri aktarımı döngüsünün devamlılık esastır. Salyangoz ev sahibi ve birincil sporocyst sahneye erken dönüştürmenin içine free-swimming miracidium dönem aşağıdaki girdiyi kritik önem taşımaktadır. Fizyolojik ve immünolojik arasında uyumluluğu sağlamak bağlı olarak ev sahibi ve parazit, larva gelişme bu aşamada o ilk başarı veya başarısızlık enfeksiyonlarına eğilimli kararlı4,5,6 kurmak için öyle . Birincil sporocysts sonra insan Enfektif cercariae oluşturmak, ikincil sporocysts eşeysiz üretebilen sonraki gelişimi daha fazla gereken tüm asıl olayın asalağın büyüme için sağlar bir keyfi fizyolojik ana ortamı ve üreme ihtiyacı var.

Bugüne kadar küçük temel hakkında fizyolojik, biyokimyasal bilinir ve moleküler süreçler, paraziti-salyangoz etkileşimleri kontrol özellikle molekülleri ve yollar larva gelişme ve üreme düzenleyen veya oransal olarak dahil ana bilgisayar bağışıklık yanıtı. Larva bu aşamaların deneysel düzenleme izni vitro kültür koşullar altında çok sayıda hazır erişim büyük gelişim yolları keşfi ve hücre büyüme, farklılaşma temel mekanizmaları kolaylaştırmak ve üreme. Kritik parazit yolları veya vitro deneyler tespit mekanizmaları, sonra larva büyüme/üreme salyangoz konak bozabilir ya da salyangoz konak immün mekanizmalar tanıma ve ortadan kaldırılması yer belirlemek için kullanılabilir miracidial veya sporocyst aşamaları.

Bu makale ve video sunumu, free-swimming S. mansoni çok sayıda izole bir yöntem ayrıntılı bir açıklama sağlamak için giriş sonra takip için deneysel tabi vitro kültür içine miracidia manipülasyon (iletişim kuralı iş akışı şematik bir bakış için bkz: şekil 1 ). Her ne kadar benzer yordamlarda açıklandığı daha önce7,8,9, biz ayrıntılı bir protokol bu modeli hala cevaplanmamış soruları ile ilgili gidermek için istihdam etmek isteyen araştırmacılar için yararlı olacağını hissettim intramolluscan larva geliştirme, hücresel proliferasyonu ve paraziti-salyangoz bağışıklık etkileşimleri. Buna ek olarak, bu yaklaşım kolayca mesane-konut S. haematobium, karaciğer flukes veya akciğer kuyruk gibi tıbbi açıdan önemli diğer trematodes yumurtadan yalıtım için adapte.

Protocol

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Wisconsin-Madison Üniversitesi iletişim kuralı altında tarafından onaylanmış yok. V005717. Bu protokol için tasvir paraziti aşamaları hiçbiri insanlar ya da diğer memeliler infektif olmasına rağmen aşağıdaki protokol bir seviye 2 (BSL2) tesis insan patojenler için çalışan içerir. Risk grubu 2 (RG2) insan patojenleri işlemek için kurumsal ilkeleri uygulayın. Not: Biz böylece dah…

Representative Results

Miracidia büyük çoğunluğu genellikle ilk iki “Hasat” toplanmış. CBSS + izole miracidia kuluçka (Şekil 4A- C) miracidium sporocyst dönüşüm sürecini tetikler. İlk bir saat içinde CBSS +, yüzme miracidia kes (şekil 4A) çoğunluğu içeren aşağıdaki kültür aktarmak kuyuları. 6 h kültür, miracidia altındadır aktif onların siliyer epidermal plakaları (şekil 4B</stron…

Discussion

Miracidia izole ve burada, açıklandığı gibi manipüle S. mansoni, sadece salyangoz ara ana bilgisayar enfekte olabilir ve bu nedenle insan bir biohazard larva gelişme bu aşamada temsil etmemektedir. Ancak, yanlışlıkla pozlama/in helezon bulaşmasını önlemek için duyarlı Biomphalaria salyangoz türleri mevcut veya tutulan nerede olabilir alanlardan farklı bir konumda miracidial izolasyonların gerçekleştirmek için özen gösterilmelidir. BSL2 alanı kayıtlı ayrı bir oda önerilir. B…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Kısmen NIH grant RO1AI015503 tarafından finanse edilmektedir. Paraziti enfekte fareler, BEI kaynaklar üzerinden dağıtım için NIH NIAID sözleşme HHSN272201000005I NIAID sistozomyas Kaynak Merkezi Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (Rockville, MD) tarafından verilmiştir.

Materials

Chernin's balanced salt solution (CBSS+) For 1L of solution
2.8 g sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Dissolve salts, except calcium chloride, and 
0.15 g of potassium chloride  Sigma-Aldrich P5405 sugars in 800 mL ddH2O
0.07 g sodium phosphate, dibasic anhydrous Fisher Scientific S374-500 Dissolve calcium chloride separately in 200 
0.45 g magnesium sulfate heptahydrate  Sigma-Aldrich M1880 mL ddH2O
0.53 g calcium chloride dihydrate  Mallinckrodt 4160 Slowly add calcium soln to the salt/sugar soln with 
0.05 g sodium bicarbonate   Fisher Scientific S233-3 with constant mixing
1 g glucose MP Biomedicals 152527 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 
1 g trehalose Sigma-Aldrich T0167 0.22 µm disposable bottle-top filter
10 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 Add filtered penicillin and streptomycin soln 
prior use
Incomplete Bge  medium (Ibge) For 900 mL solution
220 mL Schneider’s Drosophila medium modified Lonza 04-351Q Mix Schneider's medium with 680 mL ddH2O
4.5 g lactalbumin enzymatic hydrolysate Sigma-Aldrich L9010 Add lactalbumin hydrolysate and galactose
1.3 g galactose Sigma-Aldrich G0625 Adjust to pH 7.2 and filter sterilize using a 0.22 µm
pre-sterilized disposable bottle-top filter
Complete Bge medium (cBge) For 100 mL of solution
90 mL Incomplete Bge medium To heat-inactivate FBS: Incubate thawed FBS in 
9 mL heat-inact. fetal bovine serum (FBS) (Optima) Atlanta Biologicals S12450 waterbath at 60°C for 1 hr while gently 
1 mL 100X penicillin/streptomycin Hyclone SV30010 swirling the bottle every 10 min
Aliquot heat-inactivated FBS into 15-mL tubes 
and store at -20°C.  Mix medium + FBS and
filter sterilize using a 0.22 µm pre-sterilized 
disposable bottle-top filter 
Add penicillin and streptomycin prior to use
Pond water (stock solution) 1L of stock solution
12.5 g calcium carbonate Fisher Scientific C64-500 Mix all salts in 1L of ddH2O
1.25 g magnesium carbonate Fisher Scientific M27-500 Note that the salts will not have completely 
1.25 g  sodium chloride Fisher Scientific S271-3 dissolved.  Shake vigorously to suspend                
0.25 g  potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 salts prior to making the working soln  
Pond water (working solution) 1.5L of solution
0.8 mL stock solution pond water (shake prior use) in         Mix stock to ddH2O
1500 mL of ddH2O Sterilize pond water by autoclaving (slow cycle)
1.5 mL of 100X penicillin/streptomycin  Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Saline solution (1.2% NaCl) 1.5L of solution
18 g sodium chloride in 1500 mL of ddH2O Fisher Scientific S271-3 Autoclave saline solution to sterilize
1.5 mL of 100X penicillin/ streptomycin Hyclone SV30010 Add penicillin and streptomycin prior use
Additional equipment and material: 
7-L mouse euthanizing chamber Following approved IACUC protocol no. V001551
Mice Taconic Biosciences Swiss-Webster, female, 6-wk old, murine  
CO2 tank and regulator pathogen-free
24-well tissue culture plate TPP 92424
1-L volumetric flasks
Light source (150W) Chiu Tech Corp Model F0-150
Centrifuge, refrigerated, swinging bucket Eppendorf Model 5810R
Centrifuge bottles (250 mL) Nalgene
15-mL centrifuge tubes, sterile Corning 430053
Sterile disposable transfer pipets  Fisher Scientific 1371120
0.22 µm pre-sterilized disposable bottle-top filter  EMD Millipore SCGPS05RE
Stainless steel blender Waring Commercial Model 51BL31
Blender cup, 100 mL capacity Waring Commercial
Inverted compound microscope Nikon Instruments  Eclipse TE300

References

  1. Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
  2. WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
  3. Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A., Jamieson, B. G. M. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. , 118-148 (2017).
  4. Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
  5. Yoshino, T. P., Coustau, C., Toledo, R., Fried, B. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. , 159-189 (2011).
  6. Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
  7. Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
  8. McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
  9. Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
  10. Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
  11. Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
  12. Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
  13. Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
  14. Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
  15. DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
  16. Hansen, E. L., Maramorosch, K. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. , 75-97 (1976).
  17. Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
  18. Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
  19. Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
  20. Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
  21. Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191 (2011).
  22. Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).

Play Video

Cite This Article
Dinguirard, N., Heinemann, C., Yoshino, T. P. Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni. J. Vis. Exp. (131), e56345, doi:10.3791/56345 (2018).

View Video