Valutazione della permeabilità della barriera emato - encefalica dall'infusione endovenosa di albumina FITC-labeled in un modello murino di malattia di Neurodegenerative
Summary
In questo studio, presentiamo una procedura semplice ed efficace per valutare la rottura della barriera sangue – cervello sotto circostanze neurodegenerative. Per raggiungere il nostro obiettivo, abbiamo infuso isotiocianato di fluorescina di alto peso molecolare etichettato (FITC)-albumina in giugulare del mouse della vena e valutate le perdite nel parenchima cerebrale mediante microscopia a fluorescenza.
Abstract
Rottura dell’integrità della barriera emato – encefalica (BBB) è una caratteristica comune per le diverse malattie neurologiche e neurodegenerative. Anche se l’interazione tra perturbato BBB omeostasi e la patogenesi dei disordini del cervello ha bisogno di ulteriori indagini, lo sviluppo e la convalida di una procedura affidabile per rilevare con precisione la barriera ematoencefalica può essere cruciale e rappresentano uno strumento utile per la predizione potenzialmente malattia progressione e lo sviluppo di mirate strategie terapeutiche.
Qui, presentiamo una procedura semplice ed efficace per valutare la perdita BBB in condizioni neurodegenerative come quello che accade in un modello murino preclinico di malattia di Huntington, in cui i difetti della permeabilità della BBB sono chiaramente rilevabili precocemente in la malattia. In particolare, l’alto peso molecolare isotiocianato di fluorescina etichettato (FITC)-albumina, che è in grado di attraversare la BBB solo quando quest’ultima è compromessa, viene acutamente infusa di una vena giugulare del mouse e la sua distribuzione nei distretti vascolari o parenchimatici è quindi determinata da microscopia di fluorescenza.
Accumulo di verde fluorescente-albumina nel parenchima del cervello funziona come un indice di permeabilità BBB aberrante e, quando quantificati utilizzando software di elaborazione immagine J, viene segnalato come l’intensità di fluorescenza verde.
Introduction
Omeostasi all’interno del sistema nervoso centrale (SNC) è un prerequisito per la corretta comunicazione e la funzione delle cellule neuronali. Il parenchima CNS è ermeticamente sigillato dalla periferia con l’endoteliale emato – encefalica (BBB), che rappresenta l’interfaccia tra il cervello e il flusso sanguigno periferico e svolge un ruolo fondamentale nel cross-talk tra questi due distretti1 ,2. La BBB è un complesso e dinamico struttura tridimensionale composta principalmente di micro-nave endothelial cellule specializzate (ECs) collegate tra loro attraverso i complessi giunzionali intercellulari – giunzioni strette (TJs) – e circondati da periciti, neurone terminazioni e astrociti piede processi1,2.
In condizioni fisiologiche, la bassissima permeabilità della BBB intatta assicura la severa regolamentazione del trasporto di sostanze nutritive e di altre molecole dentro e fuori il cervello e fornisce il sistema nervoso centrale con un’unica protezione dai cambiamenti che si verificano nella composizione del sangue che potrebbe influenzare l’attività neurale e contro potenziale periferico insulti1,2,3.
Rottura della BBB l’integrità e la sua permeabilità migliorata lungamente è stata conosciuta per costituire una caratteristica fondamentale per molti neurologiche e neurodegenerative disturbi4 compreso la malattia di Huntington (HD)5,6, tuttavia , se una tale disfunzione è un fenomeno causativo o un evento propagativo nel corso della malattia è ancora poco chiaro. I tempi di crisi di BBB anche resta sfuggenti, tuttavia, dal nostro gruppo ed altri la prova emergente indica che perturbato BBB integrità non rappresenta un evento ritardato nella progressione di malattia, ma piuttosto un punto iniziale6,7 , 8, che può avere conseguenze a lungo termine.
Con questo in mente, è importante rivelare precocemente ripartizione BBB nella neurodegenerazione al fine di sviluppare strategie utili per predire la progressione della malattia e del danno cerebrale e sviluppare interventi alternativi e più mirati in grado di correttamente mitigare le conseguenze cliniche di tali una perturbazione. Formazione immagine affidabile di danno BBB è, pertanto, di grande importanza nella ricerca sperimentale e gestione clinica delle malattie del cervello.
In questo articolo, descriviamo una procedura semplice e di successo per la valutazione della permeabilità BBB in un modello di topo HD utilizzando l’alto peso molecolare della fluorescina isotiocianato etichettati-albumina (FITC-albumina). Stravaso di FITC-albumina, che normalmente non può attraversare la barriera, nel parenchima del cervello è stato misurato come indice di dispersione BBB. Questa tecnica è facilmente adattabile ai ratti e ad altre condizioni patologiche caratterizzate da cerebrovasculature danno9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica che descriviamo qui è utile principalmente per la rilevazione di perdite BBB in condizioni di malattia del cervello. Disfunzione BBB sta guadagnando l’attenzione come una caratteristica comune di diversi disordini neurologici4. In precedenza abbiamo utilizzato questo approccio per descrivere il derangement precoce dell’integrità BBB in un modello murino di una malattia neurodegenerativa rara come HD6.
Questo metodo si avvale della re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da “Fondazione Neuromed” e finanziato dal Ministero italiano della salute “Ricerca Corrente” di V.M.
Materials
| Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-rabbit made in goat | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cover Slips 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Mounting Media | VECTOR | H-1500 | Mounting media with DAPI |
| iNSu/Light Insulin Disposible Syringe | RAYS Health &Safety | INS1ML26G13 | |
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Needle for Insulin disposible Syringe |
| Scalpel Handle | F.S.T. | 91003-12 | |
| #22 Disposable Scalpel blads | F.S.T. | 10022-00 | |
| Fine Iris scissors 10.5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Graefe Forceps 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Medical patch | Medicalis | 34788 | |
| Sterile disposable towel drape | Dispotech | TVO50VE | |
| Stereoscopic Microscope | NIKON | SMZ 745 T | |
| Optic Illuminator LED light (C-FLED2) | NIKON | 1003167 | Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope |
| Eclipse Ni-U Microscope | Nikon | 932162 | Epifluorescence Microscope |
| Microscope digital Camera | Nikon | DS-Ri2 | Microscope camera |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Microscope lamp |
| NIS-Elements 64 bit | Nikon | AR 4.40.00 | Analysis Software |
| Electric Razor | Gemei | GM-3007 |
References
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