Preparazione delle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria nel ciclo cellulare diverse fasi di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga
Summary
Questo protocollo descrive l’uso di classificazione mediante veicolo fluido centrifuga per separare le cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria in fasi del ciclo cellulare diverso.
Abstract
La possibilità di sincronizzare le cellule è stata fondamentale per far avanzare la nostra comprensione della regolazione del ciclo cellulare. Tecniche comuni impiegate includono privazione del siero; sostanze chimiche che arrestano le cellule alle fasi del ciclo cellulare diverso; o l’uso di shake-off mitotic che sfrutta la loro aderenza ridotta. Tuttavia, tutti questi hanno svantaggi. Ad esempio, inedia del siero funziona bene per le cellule normali ma meno bene per le cellule del tumore con i checkpoint del ciclo cellulare compromessa a causa della perdita di soppressore del tumore o l’attivazione dell’oncogene. Allo stesso modo, popolazioni cellulari trattati chimicamente possono harbor danno farmaco-indotto e mostrano le alterazioni legate allo stress. Una tecnica che aggira questi problemi è elutriazione centrifugo controcorrente (CCE), dove le cellule sono soggetti a due forze opposte, la forza centrifuga e la velocità del fluido, che provoca la separazione delle cellule in base a dimensione e densità. Poiché le cellule avanzando attraverso il ciclo in genere ingrandicono, CCE può essere utilizzato per separare le cellule in fasi del ciclo cellulare diverso. Qui applichiamo questa tecnica alle cellule di leucemia linfoblastica acuta primaria. In condizioni ottimali, una popolazione essenzialmente pura di cellule in fase G1 e una popolazione altamente arricchita di cellule in fase G2/M è ottenibile in ottima resa. Queste popolazioni cellulari sono ideali per studi ciclo cellulare-dipendente meccanismi d’azione dei farmaci anticancro e per altre applicazioni. Abbiamo anche mostrare come modifiche alla procedura standard può comportare prestazioni non ottimali e discutere le limitazioni della tecnica. La metodologia dettagliata presentata dovrebbe agevolare applicazione ed esplorazione della tecnica ad altri tipi di cellule.
Introduction
Le cellule coltivate in genere crescono in modo asincrono e singole celle sono presenti nelle diverse fasi del ciclo cellulare. Alcuni organismi presentano cicli cellulari naturalmente sincroni o possono essere sincronizzati da specifici stimoli fisiologici. Ad esempio, nuclei all’interno di giganti plasmodi della muffa di melma Physarum polycephalum dividono in un modo altamente sincrono1e le cellule delle alghe verde che Desmodesmus quadricauda possono essere sincronizzati da un’alternanza di luce e buio periodi2. Mentre tali organismi offrono unici attributi sperimentali, modellano non adeguatamente la complessità delle cellule di mammiferi. La possibilità di sincronizzare artificialmente popolazioni di cellule di mammifero è stata fondamentale per far avanzare la nostra comprensione della regolazione del ciclo cellulare e le basi molecolari dei checkpoint del ciclo cellulare. Metodi comuni includono la privazione del siero, chimica blocco e rilascio o sfruttando le caratteristiche fisiche3,4. Prelievo di siero spesso induce le cellule a entrare in quiescenza, e tale aggiunta di siero promuove il rientro del ciclo cellulare in fase G15. Inibitori chimici includono gli agenti quali timidina eccedente hydroxyurea che bloccano le cellule al contorno di G1/S o inibitori del microtubulo che tipicamente arrestano le cellule in fase3,M4. Approcci che sfruttano le caratteristiche fisiche includono shake-off mitotic che può essere utilizzato per arricchire per cellule mitotiche poiché sono meno aderenti di interfase celle6. Tuttavia, tutte queste tecniche hanno svantaggi potenziali. Ad esempio, non tutti i tipi di cellule mantengono vitalità in assenza di siero o la presenza di inibitori chimici e la resa delle cellule dopo shake-off mitotica è limitato senza preventiva sincronizzazione con inibitori mitotici.
Ad eccezione dei primi cicli cellulari embrionali, dove le cellule diminuiscono progressivamente di dimensioni come dividono7, maggior parte delle cellule avanzando attraverso il ciclo di subire le fasi di crescita e diventano più grande. Questa proprietà viene sfruttata nella tecnica della elutriazione centrifugo controcorrente (CCE), che può essere utilizzato per separare le cellule differiscono per dimensioni e quindi nel ciclo cellulare fase8,9. Durante CCE, le cellule sono sotto l’influenza di due forze opposte: la forza centrifuga, che spinge le cellule dall’asse di rotazione e la velocità del fluido (controcorrente), che spinge le cellule verso l’asse di rotazione (Figura 1). Le cellule nella camera di elutriazione raggiungere una posizione di equilibrio dove queste forze sono uguali. Densità e diametro delle cellule sono i fattori chiave che dettano la posizione di equilibrio. Come il flusso del tasso della soluzione tampone è aumentato e la forza di trascinamento controcorrente supera la forza centrifuga, è stabilito un nuovo equilibrio, causando un cambiamento nella posizione delle cellule all’interno della camera. Tutte le celle vengono spostate verso l’uscita della camera, con conseguente più piccoli lasciando l’aula in primo luogo, considerando che le più grandi cellule rimanere all’interno della camera fino a quando il tasso di controcorrente è aumentato sufficientemente per promuovere la loro uscita. Le cellule fuggire la camera di elutriazione con aumenti consecutivi nel tasso di controcorrente possono essere raccolti in frazioni specifiche e ciascuna frazione contiene cellule in sequenza crescente di dimensioni. Invece di condurre elutriazione con aumenti incrementali nel tasso di controcorrente, sequenziale diminuisce in forza centrifuga diminuendo la velocità di centrifugazione compirà lo stesso risultato. Il processo di elutriazione richiede l’ottimizzazione a seconda del tipo di cellula, buffer elutriazione impiegate e le specifiche dell’apparecchio utilizzato. Il tasso di sedimentazione delle cellule in queste condizioni è meglio descritto dalla legge di Stokes: SV = [d2(ρp– ρm) / 18η] .ω2r, dove SV = velocità di sedimentazione; d = diametro della particella; Ρp = densità della particella; Ρm = densità del buffer; Η = viscosità del buffer; Ω = Velocità angolare del rotore; e r = radiale posizione della particella. Così, SV è proporzionale alla densità e diametro delle cellule, e dal momento che il diametro è elevato alla seconda potenza, contribuisce più significativamente densità che è generalmente costante durante il ciclo cellulare.
Un importante vantaggio di CCE è che le cellule non sono sottoposti a dure condizioni di trattamento chimico o privazione nutrizionale e possono essere recuperate in ottima resa essenzialmente senza scomporsi. Un requisito è che le cellule in questione subiscono un significativo aumento di diametro, di almeno il 30%, mentre attraversano il ciclo cellulare. Lo svantaggio principale è il costo della centrifuga specializzata, rotore e accessori. Tuttavia, la capacità di preparare cellule arricchite in fasi del ciclo cellulare specifico da CCE ha notevolmente facilitato ricerca ciclo cellulare negli organismi da lievito per cellule di mammifero9,10. Inoltre, i recenti progressi stanno espandendo usi alla separazione delle cellule da sano rispetto al tessuto cancerogeno, la separazione dei diversi tipi di cellule in miscugli eterogenei e per la produzione di tipi cellulari specifici per immunoterapia9.
Il nostro interesse principale è stato la comprensione del meccanismo d’azione del microtubule targeting agenti (MTA) come alcaloidi della vinca e taxani. Queste droghe sono state pensate per agire esclusivamente in mitosi, blocco mandrino microtubule funzione11,12, ma la prova recente suggerisce che possono anche rivolgersi a interfase i microtubuli13,14. Recentemente abbiamo riferito che le cellule primarie leucemia linfoblastica acuta (tutta) subiscono la morte in una fase G1 o in M di fase quando trattati con vincristina e altri MTA in un modo dipendente dal ciclo cellulare15. La capacità di separare tutte le cellule in ciclo cellulare diverse fasi di CCE è stato determinante per giungere a questa conclusione. In questo articolo, descriviamo i dettagli tecnici e offrire consigli pratici per l’applicazione di CCE per la preparazione delle primarie tutte le cellule nel ciclo cellulare diverse fasi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo descritto un metodo per ottenere primaria tutte le celle in diverse fasi del ciclo cellulare utilizzando CCE. In condizioni ottimali una popolazione essenzialmente pura di cellule in fase G1 e una popolazione altamente arricchita di cellule in fase G2/M potrebbe essere ottenuti prontamente in ottima resa, e cellule altamente arricchite in fase S possono essere ottenute anche se lo si desidera. I risultati qui presentati sono stati ottenuti utilizzando uno primario che tutta cultura (in particolare, ALL-5) ed esse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NIH CA109821 (per TCC). Ringraziamo Beckman Coulter per generosamente fornendo fondi per coprire le spese di pubblicazione e per l’assistenza tecnica nella messa a punto e funzionamento del sistema di classificazione mediante veicolo fluido. Ringraziamo il Dr. Fred Falkenburg per la fornitura iniziale primario di tutte le culture.
Materials
| Hanks' balanced salt solution | Lonza | 10-508Q | 1 L bottle |
| Fetal Plus bovine serum | Atlas Biologicals | FP-0500-A | 500 mL bottle |
| 2-napthol-6,8-disulfonic acid dipotassium salt | Acros Organics | 212-672-4 | 100 g powder |
| 50 mL concial tubes | Denville Scientifics | C1062-P | 500/case |
| PES Membrane 0.22 µm filter unit | Millipore | SLGP033RB | 250/pack |
| Avanti J-26S XPI w/ Elut. Non-IVD – 50/60 Hz, 200/208/240V | Beckman Coulter | B14544 | centrifuge compatible with elutriation system |
| JE 5.0 elutriator rotor kit | Beckman Coulter | 356900 | rotor kit which includes the rotor, T-handle hex wrench, the quick release assembly (w/o the elutriation chamber), anchoring cable, and the strobe assembly |
| Chamber, standard, 4-mL, "A" | Beckman Coulter | 356943 | standard elutriation chamber |
| Masterflex L/S Easy-Load pump head | Cole-Parmer | EW-07518-10 | |
| Masterflex L/S Variable-Speed Drive | Cole-Parmer | EW-07528-10 | |
| Masterflex BioPharm platinum-cured silicone pump tubing, L/S 16 | Cole-Parmer | EW-96420-16 | |
| 25 G x 1.5 Precision Glide needle | BD | 305127 | sterile, single-use needles |
| 10 mL Luer-Lok syringe | BD | 309604 | sterile, single-use syringes |
| Vi-Cell XR | Beckman Coulter | 383556 | |
| PI/RNase staining buffer | BD Pharmingen | 550825 | propidium iodide/RNase staining buffer |
| cyclin B1 (GNS1) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-245 | |
| cyclin D1 (DCS-6) mouse monoclonal IgG antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20044 | |
| P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 8516s | |
| GAPDH (14C10) rabbit monoclonal antibody | Cell Signaling Technology | 2118s | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6516 | |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP conjugate | BioRad | 170-6515 |
References
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