Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em> Cis</em> -preniltransferasa en<em> Escherichia coli</em
Summary
Un protocolo simple para la sobreexpresión y purificación de la cis- preniltransferasa humana optimizada con codones, en condiciones no desnaturalizantes, de Escherichia Coli , junto con un ensayo de actividad enzimática. Este protocolo puede generalizarse para la producción de otras proteínas de cis- preniltransferasa en cantidad y calidad adecuadas para estudios mecánicos.
Abstract
Las preniltransferasas (PT) son un grupo de enzimas que catalizan el alargamiento de la cadena del difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) a través de múltiples reacciones de condensación. El DHDDS (deshidrodolicil difosfato sintasa) es un cis- PT (que forma enlaces dobles cis de la reacción de condensación) eucariótico que cataliza el alargamiento de la cadena del difosfato de farnesilo (FPP, difosfato alílico) a través de múltiples condensaciones con isopentenil difosfato (IPP). DHDDS es de importancia biomédica, como una mutación no conservadora (K42E) en la enzima resulta en la retinitis pigmentosa , en última instancia, conduce a la ceguera. Por lo tanto, el presente protocolo se desarrolló con el fin de adquirir grandes cantidades de DHDDS purificado, adecuado para estudios mecánicos. En este caso, se utilizó el uso de fusión de proteínas, condiciones de cultivo optimizadas y optimización de codones para permitir la sobreexpresión y purificación de DHDDS humanos funcionalmente activos en <eM> E. Coli El protocolo descrito es simple, rentable y ahorrador de tiempo. La homología de cis -PT entre diferentes especies sugiere que este protocolo se puede aplicar para otros eucariotas cis- TP, así como los que participan en la síntesis de caucho natural.
Introduction
Las preniltransferasas son un grupo de enzimas que catalizan el alargamiento de la cadena del difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) a través de múltiples reacciones de condensación 1 , 2 . Enzimas de tipo Z catalizan la formación de dobles enlaces cis de la reacción de condensación, mientras que las enzimas de tipo E catalizan la formación de trans doble enlace 3. Las cis- priltransferasas (enzimas cis -PT, tipo Z) se clasifican clásicamente de acuerdo con la longitud de su cadena de productos en cadenas cortas (C 15 ), de cadena media (C 50-55 ) y de cadena larga (C 70-120 ) 4 . El DHDDS (deshidrodolichil difosfato sintasa) es un cis- PT de cadena larga eucariótico que cataliza el alargamiento de la cadena del difosfato de farnesilo (FPP, un difosfato alílico) a través de múltiples condensaciones con isopentenil difosfato (IPP) 1, 5 , 6 . Esto da como resultado la formación de difosfato de deshidrodolicilo, difosfato de polifenilo C 55-100 que sirve como precursor para dolicilpirofosfato, la molécula portadora de glicosilo implicada en la glicosilación de proteínas ligadas al N 1 . Entre los judíos asquenazíes, una mutación no conservadora de sentido erróneo (K42E) en DHDDS da lugar a la retinitis pigmentosa autosómica recesiva 7 , 8 . Por lo tanto, el presente protocolo se desarrolló con el fin de adquirir DHDDS purificado adecuado para estudios mecánicos.
Escherichia coli se considera el huésped más conveniente y rentable para la expresión de la proteína recombinante, y por lo tanto es también el huésped más frecuentemente utilizado. Sin embargo, cuando se intenta heterólogamente sobreexpresar proteínas en E. coli , se deben tomar consideraciones específicas de proteínas. Obtener correctamente doblado, activE las proteínas recombinantes de E. coli , no es una cuestión sencilla debido a las distintas propiedades de diferentes proteínas. Se han desarrollado numerosos enfoques para superar estos obstáculos. En este caso, se utilizó el uso de fusión de proteínas, condiciones de cultivo optimizadas y optimización de codones para permitir la sobreexpresión y purificación de DHDDS humanos funcionalmente activos en E. coli . De nota, un intento previo de sobreexpresar levadura cis- TP sin fusión de proteínas no fue exitosa debido a la insolubilidad completa, incluso en presencia de detergente [ 12] . El protocolo descrito es simple, rentable, ahorrador de tiempo y permite obtener preparados de DHDDS adecuados para estudios mecánicos. Dada la homología de cis -PT entre diferentes especies, sugerimos que este protocolo se puede aplicar para otros eucarióticos cis- TP también.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí para la purificación de DHDDS humano funcional en células de E. coli es simple y eficiente, permitiendo una sobreexpresión y purificación de la proteína en 3 – 4 días una vez que se dispone de una construcción adecuada. Tales protocolos para la purificación de proteínas son de especial importancia dado los avances en la secuenciación del genoma, que proporcionó gran cantidad de información sobre la genética de muchas enfermedades [ 18] , lo que re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Centro para la Excelencia en Investigación de la Fundación Israelí de Ciencias (I-CORE) en Biología de las Células Estructurales (1775/12) y la Fundación Israel de Ciencia otorga 1721/16 y 2338/16 (YH), y 825/14 (DK ). El apoyo de la Fundación Fields Estate a DK es muy apreciado. Este trabajo fue realizado por Ilan Edri y Michal Goldenberg en el cumplimiento parcial de los requisitos de la tesis MD de la Facultad de Sackler de Medicina, Universidad de Tel Aviv.
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
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