Método de tubo de rodillo modificado precisamente localizada y repetitiva imagen intermitente durante el cultivo a largo plazo de las rebanadas de cerebro en un sistema cerrado
Summary
Presentado aquí es un método de tubo de rodillo modificado para cultivo e intermitente proyección de imagen de alta resolución del cerebro de roedor rodajas durante muchas semanas con reposicionamiento preciso en photoetched cubreobjetos. Viabilidad neuronal y la morfología de la rebanada se mantienen bien. Se proporcionan aplicaciones de este sistema totalmente cerrado con virus para la expresión específica de tipo celular.
Abstract
Rebanadas de cerebro de roedor cultivadas son útiles para estudiar el comportamiento celular y molecular de las neuronas y glia en un entorno que mantiene muchas de sus interacciones normales en vivo . Rebanadas de una variedad de líneas de ratón transgénico o el uso de vectores virales para la expresión de proteínas fluorescencia etiquetas o reporteros en rebanadas de cerebro de tipo salvaje permiten proyección de imagen de alta resolución por microscopía de fluorescencia. Aunque se han desarrollado varios métodos para rebanadas de cerebro, combinando cultura rebanada con la capacidad para realizar la proyección de imagen repetitiva imagen alta resolución de células específicas en rebanadas vivo durante largos períodos de tiempo ha planteado problemas. Esto es especialmente cierto cuando los vectores virales se utilizan para la expresión de proteínas exógenas, puesto que esto se hace mejor en un sistema cerrado para proteger a los usuarios y evitar la contaminación cruzada. Simples modificaciones al método de cultivo rodaja rodillo tubo cerebro que permiten la repetitiva imagen de alta resolución de rebanadas durante muchas semanas en un sistema cerrado se divulgan. Rodajas en photoetched cubreobjetos de cultivo permite el uso de marcas fiduciales a rápidamente y exactamente colocar el escenario para el campo idéntico de la imagen en el tiempo antes y después de diferentes tratamientos. Se muestran ejemplos para el uso de este método combinado con tinción neuronal específica y expresión en hipocampo slice arquitectura viral mediada por la expresión neuronal de proteínas fluorescentes y el desarrollo de la patología de cofilin, que previamente se observó en el hipocampo de la enfermedad de Alzheimer (AD) en respuesta al tratamiento de la rebanada con oligómeros del péptido amiloide-β (Aβ).
Introduction
Cultivo primario de neuronas disociadas de las regiones del cerebro de roedor es un instrumento importante utilizado por los investigadores para observar respuestas a patológico implicado estímulos. Sin embargo, estos estudios tienen la desventaja de mirar las neuronas en 2D solo y sin su sistema de soporte de glial. Además, a menos que se cultivan bajo condiciones de muy alta densidad (640 neuronas/mm2 o cerca de 16% de la superficie) en el cual se convierte en imposible seguir un resultado aleatorio de una dendrita o un axón para más que una corta distancia del cuerpo celular hipocampal viabilidad neuronal durante 4 semanas LTO1, limitar el uso de culturas disociadas estudios extendidos de patologías relacionadas con la edad. El cultivo de las rebanadas de cerebro de roedor es una opción atractiva que supera estas limitaciones al mantener una arquitectura celular organizado y viabilidad durante semanas o meses. Condiciones para el mantenimiento de diferentes regiones del cerebro de roedor en sector cultura han sido descritas2.
Dos métodos principales son ampliamente utilizados para el cultivo a largo plazo de las rebanadas de cerebro: permite para girar en un incubador de rodillo para proporcionar aireación4cultivo de membranas en la interfaz aire-líquido3 o cultivo en cubreobjetos en tubos cerrados. Sectores cultivados en las membranas pueden ser directamente reflejadas con microscopía de fluorescencia de alta resolución usando un microscopio vertical y de objetivos de inmersión de agua5. Por otra parte, sectores cultivados en las membranas han sido transferidos a platos de fondo de vidrio para lograr la buena resolución de espinas dendríticas usando un microscopio invertido6. Sin embargo, ambos métodos de rebanadas en las membranas de la proyección de imagen son sistemas abiertos que requieren cambios medianas y suelen utilizan antifúngicos o antibióticos para prevenir o reducir la contaminación5,6. Rodajas en una membrana en la interfase medio aire mantienen excelente morfología y supervivencia, pero volviendo a lugares precisos en imágenes repetitivas a alta magnificación es extremadamente difícil a menos que el experimento sigue sólo pequeños grupos de células expresan un marcador fluorescente. Aunque se han utilizado láminas en membranas con viral mediada por la expresión de los transgenes5,6, protocolos de bioseguridad pueden requerir un sistema de cultivo cerrado se emplea para ciertos vectores virales que se utilizan para expresión de fluorescencia con la etiqueta proteínas y reporteros de fisiología de la célula. Además, objetivos de inmersión requieren descontaminación entre las muestras que se seguirá en la cultura5. Una aplicación importante de las culturas de interfaz de membrana es la combinación de imágenes de alta resolución con electrofisiología en vez puntos7.
El método de tubo de rodillo con cubreobjetos dentro del tubo plástico no permite cualquier electrofisiología o la proyección de imagen de alta resolución sin quitar el cubreobjetos. Por lo tanto, este método se ha aplicado más a menudo posible a los estudios a largo plazo en el que se han hecho observaciones posteriores a la fijación8. Se describe aquí es un método que utiliza la técnica de cultivo de tubo de rodillo pero en tubos perforados hacia fuera con rodajas en cubre-objetos que pueden ser reflejada repetidamente durante el tiempo que las culturas se mantiene. El sistema cerrado no requiere ningún cambio medio para la proyección de imagen y utiliza photoetched cubreobjetos para proporcionar marcas fiduciales que permiten la proyección de imagen a gran aumento, después de días o semanas, los precisos campos anteriormente reflejados.
Aplicamos este método para examinar los cambios en el hipocampo de roedor, una región del cerebro importante en la memoria y el aprendizaje. El hipocampo de roedor a menudo se estudia como modelo para patológicas o relacionadas con la edad cambios observados durante el desarrollo de deterioro cognitivo9, como las que ocurren en AD. Nuestro método está particularmente bien adaptado para el estudio de los cambios patológicos que se desarrollan dentro de una sola rebanada con el tiempo en respuesta a cambios ambientales, tales como aumento de péptidos Aβ, que es característico de AD8. Una patología asociada con cerebro humano y roedor AD es la presencia de agregados de actina cofilin y varillas, los paquetes que contiene éste de filamentos de actina y cofilin están en una relación molar 1:110,11, 12. las barras se han observado en fijadas rebanadas de hipocampo de rata después del tratamiento de Aβ, así como dentro de un trozo de cerebro de roedor vivo expresando cofilin-GFP sometido a hipoxia8, y pueden contribuir a la disfunción sináptica en AD y accidente cerebrovascular. Aquí utilizamos este nuevo método de cultivo para observar la evolución temporal y distribución dentro de rebanadas de expresadas proteínas fluorescentes quiméricas exógenas introducidas por virus diferentes. Luego utilizamos la expresión específica neuronal de una construcción de reportero cofilin para seguir el desarrollo de la barra de cofilin y patología agregada en rebanadas hippocampal en respuesta al tratamiento con oligómeros de Aß soluble (Aβo).
Protocol
Representative Results
Discussion
El método de tubo de rodillo que se describe aquí permite el cultivo a largo plazo y la proyección de imagen en alta resolución del tejido de cerebro en rodajas. Un problema importante con la técnica de corte aplicado aquí es en el montaje y mantenimiento de las rebanadas. Recubrimientos de cubreobjetos que apoyan la adhesión de la rebanada, promover la rebanada adelgazamiento por aumento de la extensión de neuritas y la migración de las células de la rodaja; así, evitamos la utilización de estos sustratos. L…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
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