Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

Summary

O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

Abstract

Dano do ADN é um fenômeno comum para cada célula durante sua vida útil e é definido como uma alteração da estrutura química do DNA genômico. Terapias de câncer, tais como o rádio e quimioterapia, apresentar a enorme quantidade de danos adicionais de DNA, levando à detenção do ciclo celular e apoptose para limitar a progressão do câncer. Avaliação quantitativa do dano do ADN durante a terapia de câncer experimental é um passo fundamental para justificar a eficácia de um agente genotóxico. Neste estudo, focamos em um ensaio de electroforese única célula, também conhecido como o ensaio cometa, que pode quantificar single e double-strand DNA quebras em vitro. O ensaio cometa é um método de quantificação de dano de DNA que é eficiente e fácil de executar, e tem exigências de tempo/orçamento baixas e alta reprodutibilidade. Aqui, destacamos o utilitário do ensaio cometa para estudos pré-clínicos, avaliando o efeito genotóxico de terapia de combinação olaparib/temozolomide U251 células de glioma.

Introduction

O ensaio cometa foi primeiro desenvolvido por Ostling e Johanson, em 1984, demonstrando que a migração do DNA fragmentos dos núcleos sob uma condição neutra¹. A técnica foi desenvolvida mais tarde por Singh et al, mostrando que uma condição alcalina aumentou substancialmente a especificidade e a reprodutibilidade do ensaio². Desde então, o ensaio cometa neutro é usado principalmente para detectar quebras de DNA dupla-hélice, Considerando que o ensaio cometa alcalino é mais sensível para pequenas quantidades de dano do ADN, incluindo único e quebra de DNA de fita dupla, alcaloide-labile sites, DNA-DNA ou Cross-linking da ADN-proteína e quebras de single-strand DNA associadas com incompleta excisão reparar sites^3,4. Ambos os ensaios permitem a visualização de DNA fragmentado e fornecem uma maneira simples de avaliar quantitativamente o dano do ADN. O ensaio cometa é considerado como um método sensível para os estudos toxicológicos in vitro e em vivo genéticos e é aplicável a áreas de investigação diferentes, tais como a seleção precoce de drogas-candidato, monitoramento ambiental, a biomonitorização humana, e fundamental Pesquisar no dano do ADN e reparar⁵.

O princípio do ensaio é que sob um campo elétrico, DNA fragmentado migra para fora do corpo do nucleoide (também conhecido como o “cabeça de cometa”) e forma uma mancha de DNA no gel do agarose (também conhecido como a “cauda de cometa”). Com coloração de nucleótidos, a extensão dos danos do DNA pode ser quantificada pela análise “cometas”, formados por electroforese esta única célula. Cálculo do momento de cauda mais pode ajudar a comparar o dano do ADN entre diferentes grupos experimentais. Em comparação com métodos tradicionais de detecção de danos do DNA, o ensaio cometa é direta, sensível, barata e relativamente simples.

Radioterapia e agentes quimioterápicos são estratégias comuns para o tratamento de câncer, gerando único filamento e quebras de DNA de fita dupla em cromossomos⁶. O avanço recente em inibidores de reparação do ADN permite um mais eficaz efeito genotóxico pela quimioterapia de combinação e, portanto, potencialmente reduz os efeitos secundários sistêmicos tais como anemia, infecção e medula óssea supressão^{7, 8}. neste estudo, mostramos a investigação de um inibidor de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), olaparib (Ola)⁹. PARP é uma proteína nuclear abundante e é responsável pelo reparo de excisão de base de DNA, formando um polímero de poli (ADP-ribose)¹⁰. Temozolomide (TMZ) é um Agente alquilante disponível por via oral e tem sido amplamente utilizada para o tratamento do paciente de glioma. Usando o ensaio cometa para quantificar os danos do DNA, demonstramos que combina olaparib com temozolomide profundamente aumenta o dano de DNA em células de glioma, que sugere a terapia combinada de olaparib/temozolomide é uma estratégia eficaz para tratar de glioma, comparado com o temozolomide sozinho¹¹.

Protocol

1. preparar reagentes 1X PBS diluir 100 mL x 10 PBS com 900 mL dH 2 O e ajustar o pH para 7,4 usando um medidor de pH. Armazenar em temperatura ambiente. Solução de lise (LS) preparar 2,5 M NaCl, EDTA dissódico de 100 mM, 10 mM Tris base e 200mm NaOH em 900 mL dH 2 O; comumente leva cerca de 20 min para permitir a mistura dissolver totalmente. Ajuste o pH a 10 usando um medidor de pH. Adicionar sarcosinate de Lauril…

Representative Results

O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho passo a passo para a execução do ensaio cometa e análise de dados (Figura 1). Resultados de ensaios os cometa alcalino e neutro, mostrou que a cauda do cometa de células U251 tratados com doxorrubicina (1 µM, 20 h) era maior e tinha maior intensidade de DNA, sugerindo um acúmulo substancial de DNA fragmentado devido à quimioterapia (Figura 2). <p class="jove_content" f…

Discussion

O ensaio cometa é uma ferramenta eficiente para medir intervalos de single e double-strand DNA a nível celular. O ensaio foi amplamente aplicado como um “padrão ouro” em estudos sobre a genotoxicidade e biomonitorização¹³, variando de ligações cruzadas base lesões, DNA, desenvolvimento de drogas e locais sensíveis do alcaloide. No presente estudo, mostramos dois protocolos distintos de passo a passo para ensaios de cometa alcalino e neutro, respectivamente. Combinando a electroforese úni…

Materials

Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free)	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma base	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
Sodium lauryl sarcosinate	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
Sodium acetate	Sigma	32318
Glacial acetic acid	Sigma	695092
Ammonium acetate	Sigma	A1542
SYBR Green	Invitrogen	S33102
Low melting point agarose	Invitrogen	16520
Agarose	Invitrogen	16500
95% ethanol	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
Trypsin	GIBICO	25300-054
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Glass tissue slides	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes	KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	DENVILLE
Pipette Tips	SHARP
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Microwave	Avanti
Waterbath	PRECISION
Horizontal electrophoresis chamber	TREVIGEN	Cometassay ES II
Power supply	Bio-Rad
Incubator	Quincy Lab	Model 12-140E
Fluorescent microscope	Zeiss	LSM700
Micropipettor	Eppendorf