Мониторинг влияние осмотического стресса на секреторные пузырьки и экзоцитоз
Summary
Осмотическая стресс влияет на экзоцитоз и количество нейромедиатора, выпущен в ходе этого процесса. Мы демонстрируем, как сочетания электрохимических методов вместе с просвечивающей электронной микроскопии может использоваться для изучения влияния внеклеточного осмотического давления на экзоцитоз активности, везикул квантовый размер и количество нейромедиатора выпустила во время экзоцитоз.
Abstract
Запись Amperometry клеток, подвергается осмотическим шоком показать, что секреторных клеток реагировать на этот физический стресс, снижая экзоцитоз активность и количество нейромедиатора, освобожден из пузырьков в одном экзоцитоз события. Было высказано предположение о том, что сокращение нейротрансмиттеров изгнаны при из-за изменений в биофизических свойств мембраны клетки сокращаться в ответ осмотического стресса и с предположения, что не затрагиваются секреторные пузырьки в цитоплазме клеток Внеклеточные осмотического стресса. Amperometry запись экзоцитоз контролирует, что освобождается от клеток момент везикул предохранители с плазматической мембраны, но не предоставить информацию о содержании везикул перед сплавливание vesicle срабатывает. Таким образом, комбинируя amperometry записи с другими дополнительных аналитических методов, которые способны характеризующие секреторные пузырьки перед экзоцитоз клеток запускается предлагает широкий обзор для изучения как секреторные пузырьки и процесс экзоцитоз, подвержены осмотическим шоком. Здесь мы опишем, как дополняя amperometry записи с внутриклеточной электрохимических цитометрии и передачи изображений электронной микроскопии (ТЕА) может использоваться для характеристики изменения в размер и нейромедиатора содержание секреторные пузырьки на хромаффинных клеток по отношению к деятельности экзоцитоз до и после воздействия осмотического стресса. Связывая количественная информация, полученная от экспериментов с использованием всех трех методов анализа, были ранее сделаны выводы секреторные пузырьки реагировать внеклеточного осмотического стресса, сокращается в размере и уменьшая квантовый размер пузырьков в поддерживать постоянное везикул нейромедиатора концентрации. Следовательно это дает некоторые разъяснения относительно почему везикулы, в ответ на осмотического стресса, снижения суммы нейротрансмиттеров, выпущенный во время выпуска экзоцитоз. Амперометрическое записи здесь указывают, что это обратимый процесс и что везикул после осмотическим шоком пополняются с нейротрансмиттерами когда помещены клетки восстанавливаются в изотонический среду.
Introduction
Хромаффинных клетках надпочечников являются нейроэндокринные клетки, что освобождение нейромедиатора молекул в поток крови. Это происходит через сотовый процесс, который включает док- и слияние заполнены нейромедиатора везикулы, привело содержание выпуска от везикулы внеклеточного пространства в процессе, называемом экзоцитоз. Нейромедиаторов (адреналина и норадреналина) в хромаффинных клетках активно транспортируется мембранных белков в большие плотные ядра везикулы (LDCVs) и хранятся в высоких концентрациях (~0.5-1 М)1,2. Накоплением нейромедиаторов внутри LDCVs достигается путем сродством катехоламинов молекул к матрице белка intravesicular плотные ядра состоит из chromogranin белки (~ 169 мг/мл)3,4,5 ,6и intravesicular коктейль раствор, содержащий ключевые компоненты для хранения и погрузки катехоламинов в пузырек например7АТФ (125-300 мм), Ca2 + (50-100 мкм в раствор и ~ 40 мм привязаны к Матрица белка)8, мг2 + (5 мм)9, аскорбиновая кислота (10-30 мм)10и рН11,~5.512. LDCVs сохранить iso осмотического состояние ячейки цитоплазмы (310 мОсм/кг)13, даже несмотря на то, что теоретические концентрации вещества внутри везикул сумма до более чем 750 мм. В состав intravesicular компонентов необходима не только для загрузки и хранения катехоламинов, но и для агрегирования растворенных веществ к матрице плотной основной белок. Это значительно снижает осмолярности везикулы значительно уменьшается и может повлиять на сумму катехоламинов, которая высвобождается при экзоцитоз5,6.
Исследования о влиянии внеклеточного осмотического давления на процесс экзоцитоз Амперометрическое записи сообщили, что высокое осмотическое давление внеклеточного подавляет активность экзоцитоз и уменьшает количество нейротрансмиттеров, выделяется из одного везикул отсеков4,14,,1516,17,18,19. Объяснения этих наблюдений спекулировали на возможное повышение макромолекулярных скученности в клетки цитоплазме ингибирующих везикул фьюжн события и изменения в мембраны биофизических свойств, влияющих на количество выпущен в ходе экзоцитоз нейротрансмиттеров. Эти мысли предположить, что высокий внеклеточного осмотического стресса не влияет на квантильного размер пузырьков, который определяет количество молекул нейромедиатора, хранящиеся в отсеке везикул на предварительной стадии вызвали экзоцитоз14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. в Амперометрическое измерения выпуска экзоцитоз в одиночных клетках, микроэлектродные диск углеродное волокно помещается в тесном контакте с поверхности клетки, создавая экспериментальная Настройка подражая синапса конфигурации, где Амперометрическое электрод служит постсинаптических детектор (рис. 1)22,23. Стимулируя клетки экзоцитоз, одно может вызвать заполнены нейромедиатора пузырьки сливаются с мембраной клетки плазмы и освободить часть или полную везикул содержание во внеклеточное пространство. Эти молекулы нейромедиатора, выпущенный на поверхности электрода может быть обнаружен электрохимически если нейротрансмиттеров Электроактивные (например, катехоламинов), применяя redox потенциал + 700 мВ против Ag/AgCl электродов ссылки . Следовательно серия тока Марк обнаружения отдельных экзоцитоз событий. Из текущего против времени след в записи Амперометрическое площадь под каждой одной Амперометрическое Спайк представляет заряда, обнаруженных за экзоцитоз событие и может быть преобразован в моль нейротрансмиттеров, выпущенный, используя уравнение Фарадея. Таким образом Амперометрическое записи количественную информацию о сумма нейротрансмиттеров, изгнаны из одного экзоцитоз событий и сообщать о частоте экзоцитоз события, но не представляют количественную информацию о секреторные пузырьки содержимое перед сплавливание vesicle и нейромедиатора релиз был начат.
Таким образом чтобы получить более глубокое понимание как секреторные пузырьки в ячейке цитоплазме реагировать внеклеточного осмотического стресса прежде чем ячейка запускается пройти экзоцитоз, другие дополнительные аналитические методы могут использоваться для обогатить эту информацию. Например расследовать если осмотического стресса изменяет объем везикул, просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) imaging анализ может использоваться для измерения размера везикул клеток после химической фиксации. Для изучения если осмотического стресс влияет на квантильного размер пузырьков, недавно разработанных Амперометрическое технику, называемую внутриклеточных электрохимических цитометрии, может применяться для количественного определения содержания везикул нейромедиатора в секреторные пузырьки в их родного государства, когда по-прежнему проживающих в цитоплазме26живых клеток. В внутриклеточного электрохимических цитометрии технику, электрод цилиндрический углеродного волокна nanotip аккуратно вставляется в цитоплазме живых клеток и, применив + 700 мВ потенциал этого электрода (против Ag/AgCl ссылка электрода), может быть определена количественно содержание катехоламинов в пузырьки путем обнаружения текущей всплеска редокс от одного везикулы столкновения, поглощения и впоследствии ковшах сверлении на поверхности электрода и высвободив тем самым их содержимое против поверхности электрода26. Таким образом в Амперометрическое текущего против время трассировки, каждое событие электромеханическая один пузырек может привести к текущей переходных и, путем интеграции области каждой текущей всплеска, Квантовый размер пузырьков можно рассчитать с помощью Faraday´s права.
Таким образом связывая количественная информация, полученная от везикул размер измерения с использованием изображений ТЕА вместе с анализом квантовый размер пузырьков, зафиксированный внутриклеточных электрохимических цитометрии, везикул нейромедиатора концентрации могут также быть определены. Это позволяет пузырьков характеристика когда клетки подвергаются воздействию различных осмотического условий и обеспечивает более четкое представление о как пузырьки могут реагировать на внеклеточные осмотического стресса на этапе до экзоцитоз. Результаты объединения этих методов показали, что при наличии внеклеточного высокое осмотическое давление, везикулы сокращаться и отрегулировать их квантильного размер и сравнивая количественную информацию о относительные изменения от этих измерений показывает, что во время усадки, везикулы отрегулировать их содержание и размер для поддержания постоянной нейромедиатора концентрации24. Таким образом это понимание является ценным в подключении к замечания, сделанные на нейромедиатора релиз в клетках подвергаются осмотического стресса. В этих протоколах мы описывают использование этих трех взаимодополняющих методологий, которые позволяют квалификация как секреторные пузырьки в их родной среде реагировать осмоляльность внеклеточной и последствия этого ответа на экзоцитоз процесс. В дополнение к наши предыдущие замечания относительно эффекта высокое осмотическое давление на экзоцитоз24мы представляем дополнительные эксперименты, которые описывают ячейки восстановления после осмотическим шоком и эффект нескольких бария стимуляцию в хромаффинных клетки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы здесь представляем, протокол и преимущества объединения трех дополнительных аналитических методов для анализа секреторные пузырьки и экзоцитоз процесс, чтобы лучше понять, как физической силы как осмотическое давление может повлиять на секреторные пузырьки и процесс экзоцитоз в ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Совет Швеции исследования (349-2007-8680) для финансирования и Котт Dalsjöfors AB (Dalsjöfors, Швеция) за пожертвование в размере говядину надпочечников.
Materials
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Collagenase P | Roche, Sweden | 11 213 857 001 | |
| 100-µM Nylon mesh | Fisher Sientific | 08-771-19 | |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1677 | |
| Collagen IV coated 60 mm plastic dish | VWR | 354416 | |
| Centrifuge | Avanti J-20XP | ||
| Borosilicate glass capillary | Sutter instrument Co., Novato, CA | ||
| Micropipette puller | Narishing Inc., Japan | PE-21 | |
| Epoxy solutions (A and B) | Epoxy technology, Billerica, MA | ||
| Beveller | Narishing Inc. | EG-400 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX81 | |
| Patch clamp Instrument | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200B | |
| Micromanipulator | Burleigh Instrument Inc., USA | PCS-5000 | |
| Butane Flame | Multiflame AB, Hässelholm, Sweden | ||
| Transmission electron microscopy | Omega | Leo 912 AB |
References
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
- Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
- Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33 (1977).
- Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
- Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
- Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
- Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
- Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. 生物化学. 17 (13), 2517-2523 (1978).
- Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
- Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
- Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
- Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
- Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
- Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
- Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
- Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
- Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
- Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
- Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).
- Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
- Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
- Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -. S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
- Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
- Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
- Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
- Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
- Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
- Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).
