Bu protokol için seri-bölüm elektron tomografi uygulanması mitokondrial Drosophila dolaylı uçuş kas yapısında aydınlatmak için göstermektedir.
Mitokondri ATP, yağlar, metabolitleri üretmek ve yanı sıra kalsiyum homeostazı ve hücre ölümü düzenleyen hücresel güçlüdür vardır. Bu organel benzersiz cristae zengini çift cidarlı ultrastructure zarif biomolecules bölümleme tarafından birden çok işlevlerini gerçekleştirecek için ayarlandı. Mitokondriyal ultrastructure çeşitli fonksiyonları ile yakından bağlantılıdır; Ancak, bu yapı-fonksiyon ilişkileri ince detaylar tarif edilebilir sadece başlıyor. Burada, mitokondrial Drosophila dolaylı uçuş kas yapısında aydınlatmak için seri-bölüm elektron tomografi uygulanması gösterilmektedir. Seri-bölüm elektron tomografi herhangi bir hücresel yapısı üç boyutlu olarak çalışmaya adapte olabilir.
Elektron mikroskobu hücre altı derlemeler ve hücresel süreçler yerine organelleri yapısal bağlamında incelemek için değerli bir araçtır. Yöntemleri ultrastructure doku ve hücreler tarafından aldehitler ile kimyasal fiksasyonu korumak için geliştirilmiştir ya tarafından yüksek basınçlı (HPF) ardından dondurma dondurma ikame (FS)1,2. Katıştırılmış numune blok sonra saat kesitli, lekeli ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile görülmektedir. HPF numune de cryo-koşul altında gibi soguk kesit veya freze ve cryo-EM3,4tarafından gözlenen odaklı iyon ışını (yalan) işleme.
İnce kesit EM bilgilendirici morfolojik anlayışlar sağlasa da, elde edilen 2D görüntüleri yalnızca belirli bir kesit ultrastructure ortaya çıkarabilir. Ultrastructure bir 3B cilt düzenlenme gizli kalır. Üç boyutlu hücresel ultrastructure görselleştirmek için nerede dizi tilt resmi satın aldı ve geri bir tomografik imar5 (şekil 1) oluşturmak için öngörülen bir elektron tomografi yöntem geliştirilmiştir. Bir çift tilt serisi örnek 90 ° döner ve ikinci bir tilt dizi edinme toplanabilir. Bu sınırlı örnekleme açılardan neden olur ve tomogram çözümlenmesi geliştirmek eksik-kama yapıların en aza indirmek olacaktır.
Burada, Drosophila dolaylı uçuş kas (IFM)6,7,8,9 mitokondriyal ultrastructure çalışmaya seri-bölüm elektron tomografi uygulanması açıklamak . 3D rekonstrüksiyonlar kapsayan tüm mitokondri (yaklaşık 2.5 µm kalınlığında) elde etmek için seri bölümler Drosophila IFM doku bloklardan elde edilmiştir. Tomograms her bölümün otomatik veri toplama yazılımı kullanarak tek tek toplanmıştır. Tomografik rekonstrüksiyonlar oluşturulan ve seri tomograms tüm bir mitokondri yeniden oluşturulan hacmi elde etmek için but paketiyle katıldı. Birleştirilmiş tomograms 3D yazılım tarafından analiz edildi. Mitokondriyal cristae yoğunlukları organizasyon üç boyutlu olarak ortaya bir segment oluşturma modeli oluşturmak için parçalara.
Bu protokol için 3D mitokondriyal ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas eğitim için seri-bölüm elektron tomografi uygulamak için en iyi duruma getirilmiş bir iş akışını açıklar. Ultrastructure örnek korunması için bu tür bir çözümleme birincil teknik mücadeledir. En iyi ultrastructure iki metodolojik korumak için adımlar dahil edildi. İlk olarak, doku doku mimari mümkün olduğunca korumak için bıçak microtome titreşimli ile kesit tarafından örnek. İkinci olarak, bir HPF/FS protokol organel ultrastructure katıştırılmış numune blokları hazırlanması sırasında korumak için optimize edildi. Numuneler suyun donma noktası düşürür ve ultrastructure1zarar buz kristalleri oluşumu azaltır, yüksek basınç altında dondurulmuştu. Örnek 0,1 mm kalınlığında anında Vitrifiye ve sonra EM analiz için numune blok oluşturmak için ikame dondurmak için tabi. Kimyasal fiksasyonu yöntemlerine göre zaman ultrastructure HPF/FS tarafından geliştirilmiş korunması belirtilmişti. Bu dizi adımı numune hazırlama için kullanarak, mitokondrial Çift Kişilik membranlar ve cristae membran korunması önemli ölçüde geliştirildi.
Seri bölümlerini numune alma yönteminin en zor adımdır. Elektron ışını penetrasyon gücü sınırlı olan bölümü kalınlığı ya 250 ile sınırlı olduğu nm veya 500 nm 200’de çalışan bir TEM kullanarak kV veya 300 kV, anılan sıraya göre. Bir mitokondri kalınlığı 2’den fazla µm olduğu için seri bölümler tam birim rekonstrüksiyonlar elde etmek için gereklidir. Ancak, tüm bir organel span için seri bölümleri yeterli sayıda kurtarma teknik bir sorundur. Yamuk bazlar arasındaki mümkün olduğunca düz olmak blok yüz kırpma daha fazla bölümleri yer sağlamak ve böylece daha büyük birimleri kapak bir yuvası ızgara izin verebilirsiniz. Ayrıca, mükemmel bir döngü için ince bölümleri kullanarak seri bölümler kılavuza aktarma başarı oranı artar.
Seri-bölüm elektron tomografi standart EM temel ekipman ile gerçekleştirilebilir. Ancak, yöntem teknik kısıtlamalar ortaya kaçınılmaz bazı sınırlamalar vardır. Biri malzeme kaçınılmaz olarak birleştirilen imar boşluklar bırakarak seri bölümler arasında kaybolur. İkinci olarak ulaşılabilir sınırlı tilt açıları nedeniyle ortaya çıkar eksik kama artifakı olduğunu. Bu kısıtlama örnek sahibi tam bir rotasyon elektron ışını engelleme olmadan açılamaz oluşur. Bu sınırlamaları rağmen seri-bölüm elektron tomografi 3D cep ve organel ultrastructure ortaya çıkarmak için yeterli çözüm sağlanır.
Daha küçük ölçekli görüntüleme için cryo-elektron tomografi makromoleküllerin kompleksleri ve derlemeler in situ alt tomografik ile birlikte nm veya alt angstrom çözünürlükte yapısını elde etmek için kullanılan bir gelişmekte olan bir teknolojidir yeniden yapılanma3. Bu uygulamada, hücreleri kesit veya altında sıvı azot freze odaklı iyon demeti inceltilerek. Tomograms nerede moleküler yapıları yerli devlet kimyasal fiksasyonu, dehidratasyon veya gömme olmadan yakın korunur cryo-koşullar altında toplanır. Belirli araç4gerektirir ölçek diğer ucunda, çözünürlük, pahasına büyük doku birimleri çözümlemek için seri blok-yüz tarama elektron mikroskobu çekici bir modalite olsa bile.
The authors have nothing to disclose.
Çalışmalar cep Enstitüsü ve Organismic Biyoloji EM özünde ve Academia Sinica, Taipei, Tayvan cryo-EM özünü yapıldı. İş Academia Sinica ve çoğu tarafından desteklenmiştir.
vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |