Metodologia per la neuromodulazione Biomimetic chimico di retine del ratto con il neurotrasmettitore glutammato In Vitro
Summary
Questo protocollo descrive un nuovo metodo per lo studio di una forma di neurostimolazione chimica del wholemount ratto retine in vitro con il glutammato, un neurotrasmettitore. Neurostimolazione chimica è un’alternativa promettente per la neurostimolazione elettrica convenzionale dei neuroni retinici per il trattamento di cecità irreversibile causata da malattie degenerative dei fotorecettori.
Abstract
Malattie degenerative dei fotorecettori causano cecità irreparabili attraverso la progressiva perdita di cellule fotorecettrici della retina. Le protesi retiniche sono un trattamento emergente per le malattie degenerative dei fotorecettori che cercano di ripristinare la visione stimolando artificialmente i neuroni retinici superstiti nella speranza di suscitare comprensibile percezione visiva in pazienti. Corrente protesi retiniche hanno dimostrato successo nel ripristinare la visione limitata ai pazienti utilizzando una matrice di elettrodi per elettricamente stimolano la retina ma affrontare notevoli ostacoli in ripristino alta acuità, visione naturale ai pazienti. Neurostimolazione chimica usando neurotrasmettitori nativi è una stimolazione alternativa elettrica biomimetici e potrebbe bypassare le limitazioni fondamentali connesse con protesi retiniche con neurostimolazione elettrica. In particolare, neurostimolazione chimica ha il potenziale per ripristinare la visione più naturale con le acuità visiva paragonabile o migliore ai pazienti iniettando piccole quantità di neurotrasmettitori, gli stessi agenti naturali di comunicazione utilizzati da Retina prodotto chimico sinapsi, a risoluzione molto più fine rispetto a protesi elettriche corrente. Tuttavia, come un paradigma di stimolazione relativamente inesplorato, non c’è nessun protocollo stabilito per raggiungere stimolazione chimica della retina in vitro. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un quadro dettagliato per l’effettuazione di stimolazione chimica della retina per i ricercatori che desiderano studiare il potenziale di neuromodulazione chimica della retina o simili tessuti neurali in vitro. In questo lavoro descriviamo la messa a punto sperimentale e la metodologia per suscitare retiniche del ganglio (RGC) spike risposte simili a visual luce le risposte delle cellule nel selvaggio-tipo e controllato retine del ratto del fotoricettore-degenerato wholemount iniettando volumi di il glutammato, un neurotrasmettitore nello spazio subretinal usando vetro Micropipette e un dispositivo microfluidico multiporta personalizzato. Questa metodologia e il protocollo sono abbastanza generale per essere adattato per neuromodulazione con altri neurotrasmettitori o anche altri tessuti neurali.
Introduction
Malattie degenerative del fotoricettore, come la retinite pigmentosa e degenerazione maculare senile, stanno conducendo ereditabili cause di perdita della visione e sono attualmente incurabile1,2. Anche se queste malattie derivano da una varietà di specifiche mutazioni genetiche, malattie degenerative del fotoricettore sono caratterizzate come gruppo dalla perdita progressiva delle cellule fotorecettrici nella retina, causando eventualmente cecità. La perdita di trigger di fotorecettori diffusa che ritocca in tutta la retina, ma sopravvivere neuroni retinici, tra cui le cellule bipolari e RGCs, rimangono intatti e relativamente funzionale anche negli stadi avanzati di fotorecettore degenerazione3 ,4,5,6,7.
I meccanismi e le patologie di queste malattie sono state ben caratterizzate3,4,5,6,7 , ma un efficace trattamento resta sfuggente. Negli ultimi tre decenni, i ricercatori in tutto il mondo hanno studiato una varietà di trattamenti terapeutici per ripristinare la visione a persone affette da malattie degenerative dei fotorecettori, tra cui gene terapia8, cellule staminali trattamento9, trapianto retinico10e stimolazione artificiale11,12 dei neuroni della retina superstiti. Di questi, il più clinicamente disponibili sono protesi retiniche, che sono dispositivi di neurostimolazione artificiale che tradizionalmente hanno utilizzato un array di elettrodi per stimolare elettricamente le cellule bipolari o RGCs secondo schemi specifici con l’obiettivo di creazione di percezioni visive artificiali in pazienti11. Protesi elettrica attuale generazione, come l’Argus II13 e Alpha-IMS14 dispositivi, hanno ottenuto approvazione clinica e studi preliminari hanno indicato che può migliorare la qualità della vita per i pazienti ripristinando un misura della visione utilizzando sia epiretinica (anteriore della retina) e subretinal (dietro la retina) impiantato dispositivi15,16. Gruppi di ricerca intorno al mondo stanno lavorando su avanzando protesi retiniche dopo i successi di questi dispositivi prima generazione17,18,19,20 ma hanno affrontato Difficoltà progettare una protesi elettrica in grado di ripristinare la visione alta acuità inferiore al livello di cecità legale ai pazienti. Recenti studi hanno dimostrato che raggiungere la maggiore risoluzione spaziale di quella attivata per la generazione di corrente elettrica basato su protesi è impegnativo a causa del limite di iniezione di carica, che richiede l’uso di elettrodi grandi per stimolare in modo sicuro neuroni retinici a costo di risoluzione spaziale, cioè l’acuità visiva11,21. Inoltre, la stimolazione elettrica è ulteriormente limitato perché in genere stimola tutte le cellule vicine e quindi suscita percezioni innaturale e confusione nei pazienti, in gran parte perché è un paradigma di stimolazione intrinsecamente innaturale21. Tuttavia, i primi successi di stimolazione elettrica hanno dimostrato che la neurostimolazione artificiale può essere un efficace trattamento per le malattie degenerative del fotoricettore. Questo porta a ipotizzare che un trattamento ancora più efficace potrebbe essere realizzabile stimolando la retina con prodotti chimici di neurotrasmettitore, gli agenti naturali di comunicazione alle sinapsi chimiche. Lo scopo del metodo presentato in questa carta è quello di esplorare la fattibilità terapeutica della stimolazione chimica, che cerca di imitare il sistema naturale di comunicazione sinaptica tra neuroni retinici, come una stimolazione alternativa elettrica biomimetici per una protesi retinica.
Traduzione del concetto di stimolazione terapeutica chimica ad una protesi retinica chimica si basa su chimicamente attivazione di neuroni retinici di destinazione con piccole quantità di neurotrasmettitori nativi, come il glutammato, rilasciato attraverso un microfluidica dispositivo costituito da una vasta gamma di microporta in risposta alla stimolazione visiva. In questo modo, una protesi retinica chimica sarebbe essenzialmente uno strato di fotorecettori artificiali biomimetici che traduce fotoni naturalmente raggiunge la retina a segnali chimici. Poiché questi segnali chimici utilizzano gli stessi neurotrasmettitori utilizzati nella segnalazione della retina normale e stimolano i neuroni retinici superstiti di un degenerato retina attraverso le stesse vie sinaptiche utilizzato da vie di visione normale, il visual risultante percezione attraverso una protesi retinica chimica potrebbe essere più naturale e comprensibile rispetto a una evocata attraverso una protesi elettrica. Inoltre, poiché il microporta attraverso il quale vengono rilasciati i neurotrasmettitori possa essere fatte estremamente piccolo e raggruppate in alta densità, a differenza degli elettrodi, un potenziale chimico protesico potrebbe essere in grado di raggiungere più stimolo focale e superiore spaziale risoluzione rispetto a una protesi elettrica. Così, una protesi retinica chimica basato su questi potenziali vantaggi, offre un’alternativa altamente promettente per protesi elettriche.
Stimolazione chimica della retina, tuttavia, è stato relativamente poco esplorata fino a poco tempo. Mentre la stimolazione elettrica della retina è stata caratterizzata bene in decenni di lavoro attraverso in vitro22,23, in vivo23,24e studi clinici13 ,14, studi sulla stimolazione chimica sono stati limitati esclusivamente a pochi in vitro opere25,26,27,28. Iezzi e Finlayson26 e Inayat et al. 27 ha dimostrato epiretinal stimolazione chimica del retina in vitro utilizzando un singolo elettrodo e una matrice multielettrodo (MEA), rispettivamente, per registrare le risposte di glutammato evocato dei neuroni retinici. Più recentemente, Rountree et al. 28 ha dimostrato la stimolazione differenziale delle vie e spegnendo retiniche con glutammato dal lato subretinal e un MEA per registrare le risposte di un neurone da più siti sulla retina.Anche se questi lavori hanno stabilito preliminarmente la fattibilità di stimolazione chimica, ulteriori studi sono essenziali per studiare molti aspetti di questo approccio di là di quelli affrontati finora25,26,27 , 28e ottimizzare i parametri di stimolazione terapeutica in modelli animali sia in vitro che in vivo prima di tradurre questo concetto ad una protesi retinica chimica come discusso in precedenza. Tuttavia, attualmente non c’è nessuna metodologia consolidata per l’effettuazione di stimolazione chimica della retina nella letteratura e i metodi utilizzati in lavori precedenti non sono stati descritti in dettaglio quanto sarebbe essenziale per gli studi replicativi. Pertanto, la spiegazione razionale per questa carta di metodi è quello di fornire un quadro ben definito per lo svolgimento in vitro stimolazione chimica della retina per quei ricercatori interessati a entrambi la replica di nostri precedenti studi27, 28 o avanzando ulteriormente questo concetto nascente di neurostimolazione chimica.
Qui dimostriamo un metodo per lo svolgimento in vitro stimolazione chimica dei neuroni retinici in wholemount retine dei ratti di selvaggio-tipo e un modello di ratto degenerato del fotoricettore che imita molto attentamente la progressione del fotorecettore degenerativa malattie in esseri umani. La spiegazione razionale dietro lo sviluppo di questo metodo di stimolazione in modelli in vitro è quello di valutare le gamme terapeutiche di vari parametri di stimolazione e studiare le caratteristiche di risposta neurale che sarebbero impossibile o difficile da osservare in in vivo modelli, soprattutto durante gli studi iniziali incentrata su valutare la fattibilità di questo approccio. In questa procedura, indichiamo sia singolo sito e simultanee multi-sito stimolazioni chimiche delle retine fornendo piccole quantità di 1 millimetro di glutammato nei pressi di neuroni retinici di destinazione via commercialmente disponibili singola porta vetro Micropipette e una consuetudine dispositivo di silicio microlavorato microfluidici multi-porta, rispettivamente. Mentre stimolazioni sia sito singolo e multi-sito compire l’obiettivo fondamentale di studiare la fattibilità terapeutica di neuromodulazione chimica, ciascuna ha uno scopo distinto con un vantaggio unico. La stimolazione di singolo sito, che può essere realizzata con Micropipette di vetro pre-stirato commercialmente disponibile, può essere usata per iniettare sostanze chimiche direttamente nel sottosuolo della retina in un unico sito e serve a indagare se osservabile RGC spike tasso le risposte che sono simili alle risposte luce visivamente evocate possono essere suscitate focale nel sito di iniezione. D’altra parte, la stimolazione multisita, che richiede un dispositivo microfluidico multiporta appositamente fabbricati, può essere usata per iniettare sostanze chimiche nello spazio a più siti sopra la superficie della retina e serve per indagare quanto bene evocato da glutammato RCG modelli di risposta corrispondono ai modelli iniezione glutammato negli studi di stimolazione del reticolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo presentato qui di seguito viene illustrato un paradigma di stimolazione neurale unico, in cui i neuroni retinici sono chimicamente stimolati iniettando sostanze chimiche nativo neurotrasmettitore nel sottosuolo della retina in vitro. Questa tecnica di stimolazione chimica offre diversi vantaggi rispetto la tecnica di stimolazione elettrica convenzionale, tra cui selettività e focale elevata specificità dei neuroni bersaglio. Il protocollo sopra dettagli come piccole iniezioni pneumatiche volume del n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro presentato nel libro è stato sostenuto dalla National Science Foundation, frontiere emergenti nella ricerca e innovazione (NSF-EFRI) programma concede numero 0938072. Il contenuto di questa carta è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NSF. Gli autori desiderano anche ringraziare il Dr. Samsoon Inayat per il suo lavoro di progettazione e collaudo il setup sperimentale iniziale per stimolazione chimica e Mr. Ashwin Raghunathan per il suo lavoro di progettazione, fabbricazione e valutazione del dispositivo microfluidico multiporta utilizzato in Questo studio.
Materials
| Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1_HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
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