세포 외 산 성 pH 문화 체계의 설립

Summary

산 성 종양 microenvironment 종양 진행에 중요 한 역할을 담당합니다. 암 세포 생체 외에서 에 산 성 세포 외 산도의 효과 평가 하기 위해 간단한 산 성 문화 시스템을 설립 했습니다.

Abstract

종양 microenvironment 영양 기아, 저 산소 증 등의 암 진행 및 암에 중요 한 역할을 한다. 그러나, 종양의 적극성 및 그것의 기본 메커니즘에 산 성 세포 외 산도의 역할은 하지 광범위 하 게 연구 되었습니다 hypoxic 또는 영양소 고갈 조건에 비해. 또한, 산 성 세포 외 종양 microenvironment을 모방 하는 잘 정의 된 문화 방법 하지 완전히 보고 되었습니다.

여기는 간단한 생체 외에서 문화 메서드 중 탄산염 및 젖 산 증가 또는 문화 매체에서 HCl 농도 감소 산 성 세포 외 산도 사용 하 여 유지 하기 위해 선물이. 중간 pH는 적어도 24 시간 동안 되었고 72 h PANC-1과 AsPC 1 췌장암 세포의 문화에 따라 점차적으로 감소. 이 연구에서는 3 가지 산 성 미디어 조건 매우 upregulated pH 반응 유전자 MSMO1, INSIG1, 및 IDI1 와 같은 산소 또는 영양 기아. 에 비해 이 유전자의 upregulation 산 성 pH의 표식으로 사용할 수 있습니다. 이 간단한 기술은 microenvironment 산 성 종양에서 종양 악성의 기본 메커니즘을 명료 하 게 도움이 됩니다. 따라서, 우리의 세포 외 산 성 pH 문화 시스템 셀룰러 산 성 pH 응답 암 세포 뿐만 아니라 1 차 셀, 신장 관 세포는 다른 산 성 장애, 당뇨병 ketoacidosis, 관계 등에서 발견을 통해 유산 증, 신장 관 산 성 증, 그리고 호흡 증.

Introduction

종양 microenvironment 종양 진행과 암 세포 물질 대사^1,2,3에 중요 한 역할을 재생합니다. 암 세포는 저 산소 증, 영양 부족, 세포 외 산 성 pH (페) 등 조건에 자주 노출 됩니다. 그러나, 종양 진행에 pHe의 역할은 하지 명확히으로 광범위 하 게 산소 또는 양분 기아에서. 종양 조직에 페 산 성, 약 산도 6.8^4,5에 도달 될 수 있다. 산 성 pH에서 양성자 (H⁺)의 호 기성 및 혐 기성 glycolytic 배설 발생 하 고 확산 암에 의해 젖 산 세포^5,6.

최근 연구 결과 밝혀 그 산 성 페 유도 히스톤 deacetylation, 지방산 산화 및 심한 산 성 환경^7,8,,910에 적응에 대 한 산 성 리소좀의 exocytosis. 그러나, 어떤 세포 외 산성화를 통해 장치 암 동작 및 산 성 pH 종양 microenvironment 레 귤 레이 터 완전히 결정 되지 않은 키의 id 영향을 줍니다. 또한, 몇 가지 보고서 중 탄산염, 트리 스, 파이프와 HEPES 버퍼 또는 젖 산 및 HCl, 불분명 한 농도 사용 하 여 다양 한 산 성 pH 미디어 설명 하지만 중간도 포괄적인의 조정 안정성을 설명 하기 위해 몇 가지 보고서 여러 독특한 산 성 문화 미디어^7,8,,910 의 비교

키 레 귤 레이 터 및 extracellular 산성화의 맥락에서 암 세포의 대사 변화를 명료 하 우리 산 성 페를 유지 하기 위해 간단한 생체 외에서 문화 모델을 설립 하 고 암 세포¹¹페의 역할을 조사 했다. 우리 37 ° C에서 5%에서 6.8의 pHe와 산 성 문화 매체를 유지 하는이 메서드를 사용 하 여 CO₂, 문화 매체에서 감소 중 탄산염 농도 사용 하 여. pH 7.4 정상적으로 사용 하 고 매체를 제어. 중간 pH는 적어도 24 시간 동안 되었고 PANC-1과 AsPC 1 췌장암 세포의 문화 중 72 h에 의해 점차적으로 감소. 향상 된 분해 가속 양성자 뿐만 아니라 젖 산^7,,89의 배설, 때문에 우리 또한 감소 하는 것 보다 젖 산을 추가 하 여 유도 하는 젖 산 증을 흉내 낸 문화 메서드를 설립 합니다 중 탄산염 농도입니다. 또한, 매체에서 HCl을 이용한 산 성 페 산 성 pH 배양 세포 응답 하지 않은 중 탄산염의 감소 된 농도 때문 가능성을 제외 수 있습니다. 또한, 다양 한 미디어를 사용 하 여 다른 중 탄산염 농도와 7.4을 6.4의 ph, 우리 세포 응답에 페 효과의 정도 평가할 수 있습니다.

Protocol

1입니다. 산 성 문화 매체의 준비 제어 (pH 7.4)의 준비 및 낮은 pH (pH 6.8) 문화 매체 4.75 g을 물 500 mL에 L-글루타민 없이 DMEM 분말의 분해. 압력 꽉 병에서 0.33 M NaHCO3 솔루션을 준비 합니다.주의: 그것은 이후 NaHCO3 CO2 가스가 열 하 고 열 분해 방출 압력 꽉 병을 사용 하는 것이 중요. 압력솥 매체 고 솔루션입니다. 이러한 버퍼를 25 ?…

Representative Results

적절 한 중 탄산염 농도 결정 하려면 우리 0-8 m m NaHCO3 (문화 매체에서 최종 농도)의 범위에서 DMEM을 준비 하 고 ph 6.4-7.4 (그림 1)에서 이르는 문화 미디어를 준비 하는 데 성공 했다. 우리는 extracellular pH pH 6.8 단단한 종양4,5에 도달 하면 주장 이전 보고서에 따르면 8 m m NaHCO3 (pH 7.4) 제어 매체, …

Discussion

여기, 우리는 간단한 산 성 pH 문화 시스템 및 그것의 평가 과정을 설명. 중간 산성화, 즉, 감소 된 중 탄산염 농도, 젖 산 추가, 및 HCl 또한의 세 가지 방법의 조합을 사용 pH-응답 메커니즘을 철저 하 게 조사 하 고 다른 종양 세포 응답을 비교 하 산소 또는 양분 기아 같은 microenvironmental 조건.

이 방법의 키 문화 매체에서 중 탄산염, 젖 산, 그리고 HCl의 적절 한 농도 결정 ?…

Materials

Reagents
Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2	Nissui	05919
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10438
NaHCO3	Wako	191-01305
L-glutamine solution	Thermo Fisher	25030-081
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)	Nacalai	09367-34
0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red	Nacalai	32778-05
0.5%-Trypan Blue Stain Solution	Nacalai	29853-34
Lactic acid solution	Sigma-Aldrich	252476
Hydrochloric acid solution	Sigma-Aldrich	H9892
RNeasy Plus Mini Kit	QIAGEN	74134
SuperScript IV First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher	18091
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4368702
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell lines
PANC-1	ATCC	CRL-1469
AsPC-1	ATCC	CRL-1682
KMS-6	JCRB Cell Bank	JCRB0432
TIG	JCRB Cell Bank
MRC9	ATCC	CCL-212
HUVEC	ATCC	CRL-1730
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi	Thermo Fisher	ND-ONE-W
QuantStudio 5 Real-Time PCR System	Thermo Fisher	CRL-1682