Summary

Измеряя экспрессии генов в бомбардировке ячменя Aleurone слои с повышенной пропускной способностью

Published: March 30, 2018
doi:

Summary

Улучшенная протокол представлен для измерения экспрессии генов переходных от репортера конструкции в клетках aleurone ячменя после бомбардировки частиц. Сочетание автоматизированных зерна, шлифовальные с 96-луночных пластины фермента анализов обеспечивает высокую пропускную способность для процедуры.

Abstract

Aleurone слой зерна ячменя является важной моделью системы для выражения гена гормона регулируется в растениях. В aleurone клетках гены, необходимые для прорастания или раннего развития сеянцев активируются гиббереллин (GA), в то время как гены, связанные с стрессом ответы активируются абсцизовой кислоты (ABA). Механизмы GA и ABA сигнализации могут быть допрошены путем введения Репортер ген конструкции в aleurone клетки через бомбардировка частиц, с результатом переходных измеряется с помощью фермента анализов. Улучшенная протокол сообщается, что частично автоматизирует и оптимизирует шаг гомогенизации зерна и assays энзима, позволяя значительно более высокую пропускную способность, чем существующие методы. Гомогенизация пробы зерна осуществляется с использованием автоматизированных ткани гомогенизатор, и GUS (β-глюкуронидазы) анализов осуществляется с помощью системы 96-луночных пластины. Представитель результаты, с использованием протокола показывают, что активность фосфолипазы D могут играть важную роль в активации HVA1 экспрессии генов, ABA, через фактор транскрипции TaABF1.

Introduction

Слой aleurone ячмень является система устоявшихся моделей для изучения выражения гена гормона регулируется в растения1. В частности ряд генов, необходимых для прорастания или раннего развития сеянцев активируются гиббереллин (GA), в то время как гены, связанные с стрессом ответы активируются абсцизовой кислоты (ABA). ГА и ABA, сигнальные пути взаимосвязаны, как выражение некоторых генов, GA-активированный тормозится Аба и наоборот1.

Ценный стратегия для понимания, что роль конкретного участников в GA/Аба сигнализации был введение эффекторных гена конструкции через бомбардировка частиц, следуют переходных выражение репортер конструкций, которые позволяют результирующий эффект на вниз по течению ген выражение определяется. Использование репортер генов как гусь (β-глюкуронидазы) или Люцифераза позволяет чувствительной и количественного измерения экспрессии генов специально внутри клетки, которые получили эффекторных конструкции. Например введение конструкцией эффекторных кодирования фактор транскрипции TaABF15,6 установлено, что Аба индуцированной генов, например HVA1 индуцированных TaABF1, а GA-индуцированной генов, например Amy32b подвергаются репрессиям. Бомбардировка частиц как экспериментальная стратегия использовала несколько лабораториями для изучения различных аспектов GA/Аба сигнализации. Такая работа привела к выявлению промоутер элементов, важных для активации GA-индуцированной2 и ABA-индуцированной генов3и к открытию киназы протеина4 и транскрипции факторы5 , которые регулируют экспрессии этих генов.

В существующие протоколы2,3,4,5,6 бомбардировка частиц и последующее измерение переходных гена выражения являются довольно трудоемким, как каждый набор бомбардировке едва зерна гомогенизированные вручную в ступку и пестик и фермента анализов осуществляется индивидуально. Эта рукопись сообщает улучшение протокол, который частично автоматизирует и оптимизирует этапа гомогенизации и GUS assays позволяют значительно более высокую пропускную способность, позволяя большее количество процедур для проверки в том же эксперимент, и/или включение более репликация для каждого лечения получить более статистически надежные результаты. Представитель результаты представлены для выражения HVA1 и Amy32b конструкций репортер, регулируется фактор транскрипции TaABF1, а также GA, Аба и других регуляторных молекул.

Protocol

1. Подготовка эффекторных и Репортер ген конструкции Построить эффекторных конструкции, которые используют учредительный промоутер (например кукурузы убиквитин, UBI) диск выражение от желаемого открытым чтение фрейма. Например Постройте плазмида, содержащие UBI::TaABF1 диск ?…

Representative Results

Метод, описанный здесь может использоваться для вилочное любой ген тест в aleurone клетки зерна ячменя. Уровень экспрессии гена теста может быть удобно измерять (рис. 2). Выше пропускная способность протокола, описанные здесь значительно увеличивает эффект…

Discussion

Введение гена эффекторных конструкции через бомбардировка частиц, следуют переходных выражение репортер конструкций является ценным стратегия для рассечения роль конкретных участников в GA/Аба сигнализации и в результате гена гормона регулируется выражение.
Однако существующие пр…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят за помощь в проведении экспериментов, Джуди камень для консультации по зерна гомогенизации и Линн Ханнум для консультации по флюометрия Грейсон Батлер и Маргарет Барретт. Эта работа была поддержана Национальный научный фонд (IOB 0443676), путем институционального развития Award (IDeA) от национального института Генеральной медицинских наук национальных институтов здоровья под номер гранта P20GM0103423 и гранты Отдел Colby Колледж естественных наук.

Materials

GeneElute HP plasmid Maxiprep kit Sigma NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer Nanodrop ND-1000
Himalaya barley grains / / A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate Sigma S2378 Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution home made / 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol Sigma C0378 Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite Fisher NC0430369 Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm) Whatman 1001 090 Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates home made / Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed) Fisher 13-812-42 Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point) Fisher 12-000-122 Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm) BioRad 1652264
macrocarriers BioRad 1652335
calcium chloride (dihydrate) Fisher C79-500 Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine Sigma S0266 Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi) BioRad 1652331
stopping screens BioRad 1652336
macrocarrier holders BioRad 1652322
Biolistic particle delivery system BioRad PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic Sigma S9763 Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2 home made / Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT) Sigma 43819 Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin Sigma L2884 Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol Sigma G5516 Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer home made / Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm) Qiagen 69989
2.0 mL tubes Eppendorf 22363352 This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser) Qiagen 85210
12mm x 75 mm glass test tubes Fisher
luciferin Goldbio LUCK-100 Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP Sigma A7699 Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base Sigma T1503 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid Sigma 258105 Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7 home made / Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride Sigma M9397 Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB) home made / Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture home made / Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius) Berthold /
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) Goldbio MUG1 Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide Sigma S8032 Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard) Fisher 12565501
GUS assay buffer home made / Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film USA Scientific 2921-1000
96 well plates (black) Costar 3916
sodium carbonate Sigma S7795 Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader Bio-Tek FLX-800

References

  1. Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
  2. Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
  3. Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
  4. Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
  5. Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
  6. Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
  7. Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
  8. Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
  9. Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
  10. Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
  11. Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
  12. Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
  13. Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
  14. Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
  15. Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
  16. Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).

Play Video

Cite This Article
Uwase, G., Enrico, T. P., Chelimo, D. S., Keyser, B. R., Johnson, R. R. Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput. J. Vis. Exp. (133), e56728, doi:10.3791/56728 (2018).

View Video