Summary

Protocolo experimental para detectar la función mitocondrial en hepatocitos expuestos a plaguicidas organoclorados

Published: September 16, 2020
doi:

Summary

Comprender la influencia de los pesticidas organoclorados ambientales (OCP) en la función mitocondrial en los hepatocitos es importante para explorar el mecanismo de los OCP que causan trastornos metabólicos. Este artículo presenta métodos detallados para detectar la función mitocondrial hepática.

Abstract

Este artículo presenta métodos detallados para detectar la función mitocondrial hepática para comprender mejor la causa de los trastornos metabólicos causados por los pesticidas organoclorados ambientales (OCP) en los hepatocitos. Las células hepG2 se expusieron al hexaclorociclohexano durante 24 h a una dosis equivalente de exposición interna en la población general. La ultraestructura en los hepatocitos se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) para mostrar el daño de las mitocondrias. La función mitocondrial se evaluó aún más por la intensidad de fluorescencia mitocondrial, los niveles de adenosina 5′-trifosfato (ATP), la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en células hepox2 incubadas con HCH. La intensidad de fluorescencia de las mitocondrias después de mancharse por la sonda fluorescente verde mitocondrial se observó con una microscopía de fluorescencia. La reacción luciferina-luciferasa se utilizó para determinar los niveles de ATP. El MMP fue detectado por el tinte catiónico JC-1 y analizado bajo citometría de flujo. El OCR se midió con un analizador de flujo extracelular. En resumen, estos protocolos se utilizaron en la detección de la función mitocondrial en hepatocitos con para investigar los daños de las mitocondrias.

Introduction

Los efectos de los plaguicidas organoclorados (OCP) en la salud, por ejemplo, interferencia reproductiva, toxicidad inmunológica, cambios metabólicos se han estudiado previamente1,2,3. Los métodos para detectar el metabolismo celular y descubrir la disfunción mitocondrial han permitido a los científicos comprender el papel de la función mitocondrial(es decir., niveles de STAT3 mitocondrial, lactato, piruvato, relación lactato-piruvato, coenzima Q10, fuga de protones mitocondriales, bioenergética, biogénesis y dinámica) en áreas como el envejecimiento, la obesidad, la diabetes, la función cardiovascular, el cáncer y la toxicidad para la seguridad4,,5,6,7. En este artículo, describimos los métodos para evaluar la disfunción mitocondrial causada por los OCP.

Hemos expuesto las células de HepG2 a un O-hexaclorociclohexano , un OCP representativo, durante 24 h a una dosis equivalente a la exposición interna de humanos. En primer lugar, se aplicó TEM para observar la ultraestructura de los hepatocitos, como núcleos, mitocondrias y retículo endoplasmático8. En comparación con los microscopios ordinarios, TEM permite explorar la ultraemetría 2D y 3D de células y componentes celulares (líneas celulares o tejidos), la morfología, composición química, así como la función de materiales naturales o artificiales que juegan un papel fundamental en la ciencia y la tecnología modernas. La función mitocondrial se evaluó aún más por la intensidad de fluorescencia mitocondrial, los niveles de adenosina 5′-trifosfato (ATP), la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en células hepox2 incubadas con HCH. El verde mito-tracker es una sonda fluorescente verde de las mitocondrias que se puede utilizar para la tinción fluorescente específica de la célula viva. Las mitocondrias en los hepatocitos fueron manchadas por solución verde mito-tracker y se observó intensidad de fluorescencia mitocondrial, número y patrón con una microscopía confocal9. La sonda fluorescente verde mitocondrial se puede utilizar para manchar las células vivas. En comparación con la rhodamine 123 o JC-1, la sonda fluorescente verde mitocondrial no depende del potencial de membrana mitocondrial para la tinción mitocondrial. Los niveles de ATP fueron determinados por un kit de luciferasa-luciferina y normalizados por la concentración de proteínas. Kit de ensayo de ATP se puede utilizar para detectar los niveles de ATP en soluciones comunes, células o tejidos. Este kit se basa en la luciasa de lucilyzed por fluoresceína para generar fluorescencia, cuando se requiere ATP para proporcionar energía. Cuando la luciasa de la luciosa y la fluoresceína son excesivas, en un cierto rango de concentración, la generación de fluorescencia es proporcional a la concentración de ATP. Además, este kit ha sido especialmente diseñado para optimizar la quimiuminoscencia de ATP. ATP, como las moléculas de energía más importantes, juega un papel importante en los diversos procesos fisiológicos o patológicos de las células. Los cambios en los niveles de ATP pueden reflejar defectos en la función celular, especialmente la producción de energía mitocondrial. Generalmente bajo apoptosis, necrosis o en algún estado tóxico, los niveles celulares de ATP redujeron 10. El kit de ensayo de MMP con JC-1 es un kit que utiliza JC-1 como sonda fluorescente para detectar células, tejidos o MMP purificados de forma rápida y sensible. Se puede utilizar para la detección temprana de apoptosis. El tinte catiónico JC-1 es una sonda fluorescente utilizada para detectar el MMP que se puede analizar bajo citometría de flujo indicada por cambios de relación de fluorescencia verde y roja. Cuando el MMP es alto, JC-1 se agrega en la matriz de las mitocondrias para formar un polímero (J-agregados), que produce fluorescencia roja. Cuando el MMP es bajo, JC-1 no se puede acumular, y forma monómero que produce fluorescencia verde11. Así que la proporción de fluorescencia roja y verde puede reflejar el nivel de MMP. El OCR de las células es un indicador crucial de la función celular normal12. Se considera como un parámetro para investigar la función mitocondrial. El kit de prueba de esfuerzo de mito celular proporciona un método estable para analizar los parámetros clave de la función mitocondrial. El kit proporciona control de calidad y reactivos predictivos, así como un método estándar para realizar pruebas de esfuerzo mitocondrial celular. Se puede utilizar para detectar todos los tipos de células, incluidas las células primarias, las líneas celulares, las células suspendidas, y también para los islotes, los nematodos, las levaduras y las mitocondrias aisladas.

La medición de OCR puede proporcionar información valiosa sobre el estado fisiológico o alteraciones de las células. Se determinó con un analizador de flujo extracelular para detectar la línea de base respiratoria, fuga de protones, respiratoria máxima, rotación de ATP y capacidad de reserva. En resumen, después de las mediciones basales de OCR, OCR se detectó después de agregar secuencialmente a la oligomicina (ACOPLAdor ATP), FCCP (desacoplador de fosforilación oxidativa mitocondrial) y antimicina A/ rotenona (un inhibidor del consumo de oxígeno) por pozo.

En un esfuerzo por facilitar el desarrollo de un protocolo más específico para la detección de la función mitocondrial en hepatocitos in vitro, presentamos aquí experimentos por TEM, microscopía confocal, luminómetro, citometría de flujo y analizador de flujo extracelular con aplicación futura en el estudio de los resultados adversos relacionados con el daño de las mitocondrias.

Protocol

Todos los experimentos y los protocolos del experimento se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes y fueron aprobados por el Comité ético local de la Universidad Médica de Nanjing. 1. Ultraestructura mitocondrial por TEM Recolección de células HepG2 Células HepG2 de semilla en platos de 100 mm. Conservar a 37oC y 5% de CO2. Disetique las células con 0,25% EDTA en tubo de 1,5 mLEP. Centrífuga a 1000 x g<…

Representative Results

Las mitocondrias cristae de las células de HepG2 expuestas a la HCH fueron marcadamente dañadas. Las mitocondrias dispersas fueron levemente expandidas, de forma irregular, y la cresta mitocondrial desapareció con una arquitectura mitocondrial relativamente anormal (Figura 1). Intensidad media de fluorescencia verde mitocondrial, que representa las mitocondrias, disminución en las células de He…

Discussion

Crítico para el éxito del protocolo de detección es el uso de una variedad de métodos experimentales que se han cubierto el estudio desde el fenotipo hasta el mecanismo. En este estudio, las células HepG2 se cultivaron en DMEM con penicilina y estreptomicina y 10% de suero bovino fetal. Cuando las células alcanzaron el 40-50% de confluencia, se añadieron e incubaron los HCH (0, 10, 100 ng/ml) durante 24 h. En primer lugar, utilizamos TEM que mostró los cambios ultraestructurales en el hepatocito causados por los …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant Nos. 81573174, 81570574); el Fondo Para la Juventud Sobresaliente de la Provincia de Jiangsu (SBK2014010296); el Proyecto de Investigación del Ministerio de Educación de China (213015A); el Desarrollo prioritario del Programa Académico de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD), el desarrollo principal emblemático de las instituciones de educación superior de Jiangsu; y el Programa de Proyectos Abiertos del Laboratorio Estatal clave de Química Ambiental y Ecotoxicología (KF2015-01).

Materials

Transmission electron microscope  FEI Tecnai G2 Spirit Bio TWIN High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance
Mito-Tracker Green Beyotime C1048 Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.
Laser scanning confocal microscope Zeiss 700B The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to  produce a perfect 3-dimensional specimen image.
Enhanced ATP Assay Kit Beyotime S0027 Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.
Luminometer Berthold Centro LB 960 Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.
BCA Protein Assay Kit Beyotime P0012 BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.
Multimode reader TECAN InfiniteM200 Multimode reader be used to detect protein consentration.

References

  1. Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
  2. Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
  3. Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
  4. Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
  5. Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
  6. Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction. Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).
  7. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
  8. Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
  9. Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
  10. Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
  11. Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
  12. Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
  13. Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
  14. Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
  15. Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
  16. Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
  17. Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
  18. Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
  19. Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
  20. Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
  21. Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
  22. Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
  23. Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
  24. Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
  25. Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).

Play Video

Cite This Article
Liu, Q., Jiang, Z., Gu, A. Experimental Protocol for Detecting Mitochondrial Function in Hepatocytes Exposed to Organochlorine Pesticides. J. Vis. Exp. (163), e56800, doi:10.3791/56800 (2020).

View Video