このプロトコルを目指して、ナノコーティングのN-グループと膵島のアミン グループ間の擬似 bioorthogonal 化学を介してヘパリン含有 starPEG ナノコーティングを使用して膵島の表面加工細胞膜。
細胞表層工学は、ホストの免疫の攻撃から注入された細胞を保護します。移植機能を改善するために細胞の風景を変形することがも、移植後の生存。このプロトコルは、極薄ヘパリン-株式会社 starPEG (Hep PEG) ナノコーティングを使用して膵島の表面加工を目指しています。ヘパリン染色コハク酸 (ヘパリン-NHS) 膵島表面工学 Hep ペグ ナノコーティングを生成するためのカルボキシル基を n–(3-dimethylamino propyl) を使用しての改造によって合成されたN’-エチル カルボジイミド塩酸 (EDC) とNヒドロキシスクシンイミド (NHS)。Hep PEG 混合物はアミノ末端 8 武装 starPEG (starPEG-(NH2)8) とヘパリン NHS の架橋によって形成されたし。膵島の表面コーティング、マウスの膵島はコラゲナーゼの消化力と Histopaque を使用してグラデーションの浄化によって分離されました。膵島は、NHS と膵島細胞膜のアミン グループの結合を許可する 10 分間氷冷 Hep PEG 溶液と扱われたし。Hep ペグとナノコーティングは膵島のサイズに最小限の変更とボリュームと Hep ペグと小島のパリン投与群も膵島移植中にインスタントの血液を介した炎症反応を減らすことができます。この「簡単-導入するため”のアプローチ、細胞生存率を損なうことなく生きている細胞の表面加工の穏やかなです。無制限機能生物学的仲介人および生活のため多層表面の結合を可能にするオープンなプラットフォームを提供します、また Hep ペグ ナノコーティングをヘパリンが複数サイトカインに結合親和性を示していることを考えると、細胞表面バイオ エンジニア リング。
細胞ベースの治療法の治療効果は、低細胞保持と貧しい人々 の生存1,2によって制限されます。細胞療法の転帰を改善、細胞表層工学酵素操作を介して、するためにペプチド共役、bioorthogonal 化学、生体材料の物理的なカプセル化されて悪用された3,4、 5,6,7,8,9,10。現在のプロトコルは、極薄ヘパリン-株式会社 starPEG (ヘパリン-PEG) ナノコーティングを細胞表面に適用することによって「簡単-導入するため「法を用いた生細胞の表面加工を目指しています。膵島の表面加工が発表されたランゲルハンス島と現在臨床膵島移植の中傷の成果の異種の性質として紹介。
確かに、臨床膵島移植、肝門脈に膵島を直接注入によって実行されます現在、この操作はのみ選択的患者のドナー材料と低治療有効性の不足のため11. アルギン酸の炎症関連線維症の12、化学的不安定性による理想的な未満が従来、アルギン酸がカプセル化膵島と表面改質のための最も一般的に使用される生体材料にされています。 13。さらに、100 に 200 μ m の間の範囲島の本来のサイズと比較して、アルギン酸アイレット マイクロ カプセルが大きくなり、400 と 800 μ m の間で及ぶこれは酸素の生理学的な拡散距離を超えます。等角アイレット カプセル化、すなわち。 はそれから開発され、膵島ボリュームの大幅な変更することなく島をカプセル化します。したがって、ナノの成膜から成るペグ、テトラフルオロ エチレン、シリコン膜や多層ナノコーティング (「–層」[LBL] 技法として知られている) が報告されたが、改良体外アイレット生存14 の結果17,18,, ,,1516LBL は頻繁にアプローチが必要な広範な膵島の生存を危険にさらす可能性があります複数のレイヤーの沈着量の期間を渡す.また、生体膜層のナノと膵島の表面の疎水性相互作用静電または共有結合性の相互作用に依存するナノの不安定性も懸念9,14を発生させます,15,16,22,23,24,25,26。
門脈内の膵島移植の治療成績を妨げる別の要因は、インスタント血液を介した炎症反応 (IBMIR) 血、血小板凝集の結果で移植膵島の直接的接触によるもの凝固、免疫悪影響または望ましくない細胞活性9。これらの問題に対処するため星形ポリエチレン ・ グリコール (starPEG) から成る超薄型ナノコーティングは確立された生体適合性と汎用性膵島ハウジングの材質として準備されました。高硫酸化グリコサミノグリカン、ヘパリンは抗炎症、抗凝固剤のプロパティのプロ血管新生増殖因子22を勧誘することによって血管新生を促進する能力 starPEG ナノコーティングでも設立 23。
この記事での生活のための”簡単-導入するため「アプローチを示す細胞表層工学ナノコーティングのN-グループ間の擬似 bioorthogonal 化学を介してヘパリン含有 starPEG ナノコーティングと膵島表面膜のアミン グループ。確かに、細胞膜内のアミノ基は非常に反応性とその結果、以前の研究は14 の生理学的条件下で活性化のN– hydroxysuccinimidyl (NHS) エステルの第一アミノ基間の相互作用を報告しています。 ,16,21。さらに、広範な研究は、カプセル化膵島の中にヘパリン、高硫酸化グリコサミノグリカンおよび細胞外のマトリックスの重要なコンポーネントの結合が強化された移植後につながることを報告しています。血行再建術と減らされた IBMIR22,23。ペグの生体適合性とヘパリンの多価の特性を考えた、ナノコーティングの作製中に読み込む最大のヘパリンの 8 武装ペグを使いました。ヘパリン -NHS、その後 -NH2基と反応が膵島細胞膜上で変更されました。ヘパリン法人 PEG によって共有結合形成 (細胞膜) の NH の2と – Hep ペグの NHS の間小島は容易に「コーティングする」を有効にすれば、このように膵の外側の表面にナノ薄層 (ナノコーティング) を形成小島。
現在のアプローチはまた擬似 bioorthogonal 化学 -NHS (のナノコーティング) と -NH2膵島細胞の間に島をマイクロ カプセル化の主要な高分子として PEG を選択以前に公開されたメソッドから別膜が使用されました。膵島細胞の安定性を考慮したコーティング、プラズマなどの複雑な環境では特には血行再建後の移植することが重要であり生存、NHS – と -NH2間の地層より安定したに比べてペグと細胞膜24、静電相互作用9,15,24,25,26またはビオチン間生物学的連結間の疎水性相互作用ストレプトアビジン14。
さらに、膵島と対照をなしても多層蒸着14,16,25, 本手法の拡張膵島取扱い期間で LBL のアプローチに依存しているコーティング方法必要最小限です。膵島のコーティングの期間の処理および非常に短いこれらの要因の両方は、島の生存率は頻繁に既に酵素消化中に破損した ECM による侵害の次膵島分離膵島移植後生存に不可欠です。しかし、現在のアプローチの 1 つの制限は、これを介して外のコーティングの厚さを増やすまたは層堆積の数を減らすことによって制御できる LBL とは異なり Hep ペグ ナノコーティングの厚さを当分の間合わせて調整することはできません、です。
さらに、-NHS と -NH2行われる、現在のアプローチ間の化学反応は細胞の軽度の状態により表面ない工学は膵島、しかしほとんどの細胞療法に限る。さらに、ヘパリンはサイトカイン ・生理活性分子の範囲との対話を知られていることを考えると、Hep ペグ ナノコーティング述べる無制限生物調停の成立の可能性があるオープンなプラットフォームと同様複雑な細胞表層工学のためのインターフェイス。
The authors have nothing to disclose.
中国の国家自然科学基金 (31770968) と天津研究プログラムのアプリケーション基盤と高度な技術 (17JCZDJC33400) の支援に感謝しております。
Reagent | |||
PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
Streptozototin | Sigma | S0130 | |
Histopaque | Sigma | 10831 | |
RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |