Partielle Gallengang Ligation in der Maus: eine kontrollierte Modell der lokalisierten obstruktive Cholestase
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen teilweise Gallengang Ligatur als chirurgische Modell der Leberschädigung und Regeneration bei Nagetieren.
Abstract
Bei Nagetieren ist komplette Gallengang Ligatur (cBDL) der Hauptgallengang eine etablierte chirurgische Methode zur Untersuchung obstruktiver Cholestase und Gallengang Verbreitung. Langzeitexperimente können jedoch zu erhöhter Morbidität und Mortalität führen. In ausgewählten Mausstämme mit zugrunde liegenden Lebererkrankung können sinnvolle Vergleiche auch mit Ligatur der einer einzelnen Leberlappen, erfolgen die tierischen Verluste und Kosten reduzieren können. Hier beschreiben wir teilweise Gallengang Ligatur (pBDL) in der Maus, in der nur die linken hepatischen Gallengang ligiert ist, verursacht biliären Obstruktion in der linke Lappen aber nicht die restlichen Lappen. Mit sorgfältiger mikrochirurgische Technik können pBDL Experimente kostengünstig sein, da der unligated Lappen als interne Kontrolle, die aufgespaltenen Lappen dient, wenn Sie den gleichen Bedingungen in der selben Tier ausgesetzt. Im Gegensatz zu cBDL ist eine separate Schein betrieben Kontrollgruppe nicht notwendig. pBDL ist sehr nützlich um direkt vergleichen lokalisiert versus systemische Wirkungen von Cholestase und anderen Gewinnrücklagen Galle Komponenten. pBDL kann auch als eine neuartige Methode zu untersuchen, Mechanismen, die im Zusammenhang mit Medikamenten und Zellwanderung verwendet werden.
Introduction
Chirurgische Modelle der akuten Leberschädigung und Reparatur, wie teilweise Hepatektomie oder Gallengang Ligatur (cBDL), wurden seit Jahrzehnten bei Nagetieren zur Leberregeneration und Pathobiologie1,2zu studieren. In cBDL ist der Hauptgallengang (die alle Galle in der Leber produziert Kanalisation) ligiert, was obstruktive Cholestase, Entzündung und Fibrose in den ersten 2-3 Wochen nach der Operation, mit eventuellen Progression zur Leberzirrhose3. Gallengang Proliferation, Transdifferenzierung und Induktion von resident Leber Vorläuferzellen sind auch Funktionen von cBDL4,5. Obwohl cBDL spezifische Mechanismen der obstruktiven Cholangiopathy die gut-gekennzeichneten mit reproduzierbaren Ergebnissen in Wildtyp Mäusen und in dieser Stämme mit normalen Leber6,7,8 verdeutlicht, die Verfahren kann in einigen transgenen Mausmodellen von Lebererkrankungen, erfordern mehr Tiere als auf Grund der höheren Morbidität und Mortalität der biliären Obstruktion im Laufe der Zeit zu erwarten technisch anspruchsvoll sein. Diese Technik ist auch vorteilhaft für das Studium transgener Mäuse mit zugrunde liegenden Leber-Krankheit, die den Stress des längere Zeit Kurs Experimente nach cBDL sonst nicht tolerieren könnten.
pBDL bieten eine sinnvolle Alternative zu helfen, diese Herausforderungen zu überwinden. Erste pBDL Studien in Wildtyp Mäusen mit dem Ziel, lokal handelnde und systemische Mediatoren der Entzündung9zu unterscheiden. In pBDL die wichtigsten biliären Zusammenfluss der rechten und linken hepatischen Gallenwege über den Gallengang wird sorgfältig auf die Hilum visualisiert und nur die linken hepatischen Gallenwege ist um eine lokalisierte obstruktive Cholestase generieren ligiert. pBDL bietet mehrere Vorteile, cBDL. In pBDL dient der unligated Rechte Lappen als identisch übereinstimmenden interne Kontrolle für die aufgespaltenen linke Lappen, die gleichen systemische Effekte, wie Ernährungszustand oder zirkulierenden Faktoren ausgesetzt. Obwohl systemische Pro-inflammatorischen Mediatoren anwesend waren, Osawa Et Al. beobachtet weniger Fibrose und Nekrose in der unligated Lappen, aber erhöhte Entzündungszellen und transformierende Wachstumsfaktor β Ausdruck in der aufgespaltenen Lappen-9.
In jüngerer Zeit, umdefiniert pBDL, um Leber parenchymal einbehaltene Galle10zu untersuchen. Mithilfe der gleichen Tier für interne Kontrolle (unligated “Schein”) und Versuchsgruppen halbiert pBDL effektiv die Anzahl der Tiere pro Experiment, welches wiederum kostengünstiger ist. Die Mäuse vertragen die Auswirkungen der pBDL viel besser, so dass der ideale Zeitpunkt Kurs experimentieren (≥2 Wochen) in der aufgespaltenen Lappen erreicht werden können. Vor allem pBDL direkte intrahepatischen Auswirkungen der obstruktiven Cholestase unterscheiden kann und Galle Komponenten in der aufgespaltenen Lappen, im Vergleich zu der unligated Kontrolle Lappen beibehalten. Insgesamt ist die pBDL eine attraktive Methode, Lappen-spezifische Effekte der lokalisierten Cholestase in der Leber zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl cBDL die häufigste experimentelle Technik für obstruktive Cholestase ist, kann es mehrere Herausforderungen bei Nagetieren präsentieren. Abhängig von der Anzahl der postoperativen Tage benötigt, um einen Endpunkt zu erreichen können die Tiere erhebliche Morbidität und Mortalität mit fortschreitender Zeit erleben. Der Grad der Gewebeverletzung und biliären Nekrose wird weiter verschärft, bei der Arbeit mit einigen transgenen Mausmodellen der Lebererkrankung, die abnorme Leberparenchym und Funktion zu Stud…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Khan bestätigt Zuschüsse aus NIH/NICHD K12HD052892, Alpha-1-Stiftung, Stiftung Hillman und Pittsburgh Leber Research Center. Dr. Michalopoulos erkennt Zuschüsse aus NIH/NIDDK P01DK096990. Wir freuen uns über die hervorragende und großzügige technische Hilfe von Anne Orr. Wir sind auch für den Zugriff auf die Transplantation/Nagetier Mikrochirurgie-Labor Dr. David A. Geller dankbar.
Materials
| Microscope-Leica Wild M650, 6–40× magnification | Leica Microsystems | n/a | |
| Tec 3 isoflurane funnel fill vaporizer | General Anesthetic Services | n/a | |
| Stevens Tenotomy Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments Corporation | ASSI.9193 | |
| Adson Forceps | Fine science tools | 11006-12 | |
| Mosquito classic delicate hemostatic forceps | Codman | 30-4472 | |
| Micro-retractor | Murdock; Roboz Surgical Instrument | RS-6550 | |
| Nonwoven gauze sponges | Fisherband | 870-PC-DBL | |
| Puritan 6” Small Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company | 868-WCS | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-23 | |
| Dumont SS Forceps – Standard Tips/Angled 45°/Inox/13.5cm | Fine science tools | 11203-25 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine science tools | 15000-00 | |
| Microneedle holder | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | |
| Micro AROSuture, sterile 10-0 nylon suture, 70 µm, TAP points | AROSurgical Instruments Corporation | T4A10N07 | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J662H | |
| 5-ml Syringe | BD | 309646 | |
| Falcon tissue culture dish, 60 × 15 mm | Corning | 353002 | |
| Isoflurane, United States Pharmacopeia (USP) liquid for inhalation, 250 ml | Piramal Healthcare | NDC 66794-017-25 | |
| Buprenex injectable (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals | NDC 12496-0757-1 | |
| Cefazolin for injection , USP | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-238-61 | |
| PVP scrub solution (povidone–iodine 7.5%) | Medline | NDC 12496-0757-1 | |
| 70% Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| Phosphate Buffered Saline Without Calcium or Magnesium | LONZA | 17-516F | |
| Sirius Red | Sigma | 365548 | |
| Hematolxylin | Fisher (Richard-Allan Scientific) | 22-050-111 (7211) | |
| Eosin | Anatech (Fisher) | 832 (NC9686037) | |
| Formalin | Fisher | SF100-20 |
References
- Higgins, G. M., Anderson, R. Experimental pathology of the liver – Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Cameron, G. R., Oakley, C. L. Ligation of the common bile duct. The Journal of Pathology and Bacteriology. 35 (5), 769-798 (1932).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Michalopoulos, G. K., Barua, L., Bowen, W. C. Transdifferentiation of rat hepatocytes into biliary cells after bile duct ligation and toxic biliary injury. Hepatology. 41 (3), 535-544 (2005).
- Dipaola, F., et al. Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice. Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).
- Guyot, C., Combe, C., Desmouliere, A. The common bile duct ligation in rat: A relevant in vivo model to study the role of mechanical stress on cell and matrix behaviour. Histochem Cell Biol. 126 (4), 517-523 (2006).
- Zhang, Y., et al. Effect of bile duct ligation on bile acid composition in mouse serum and liver. Liver Int. 32 (1), 58-69 (2012).
- Tag, C. G., et al. Bile duct ligation in mice: induction of inflammatory liver injury and fibrosis by obstructive cholestasis. J Vis Exp. (96), e52438 (2015).
- Osawa, Y., et al. Systemic mediators induce fibrogenic effects in normal liver after partial bile duct ligation. Liver Int. 26 (9), 1138-1147 (2006).
- Khan, Z., et al. Bile Duct Ligation Induces ATZ Globule Clearance in a Mouse Model of alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Gene Expr. 17 (2), 115-127 (2017).
- Birkhead, H. A., Briggs, G. B., Saunders, L. Z. Toxicology of cefazolin in animals. J Infect Dis. 128, 378 (1973).
- Kunst, M. W., Mattie, H., van Furth, R. Antibacterial efficacy of cefazolin and cephradine in neutropenic mice. Infection. 7 (1), 30-34 (1979).
- Traul, K. A., et al. Safety studies of post-surgical buprenorphine therapy for mice. Lab Anim. 49 (2), 100-110 (2015).
- Carlson, J. A., et al. Accumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest. 83 (4), 1183-1190 (1989).
- Sifers, R. N., Finegold, M. J., Woo, S. L. Alpha-1-antitrypsin deficiency: accumulation or degradation of mutant variants within the hepatic endoplasmic reticulum. Am J Respir Cell Mol Biol. 1 (5), 341-345 (1989).
- Rudnick, D. A., Shikapwashya, O., Blomenkamp, K., Teckman, J. H. Indomethacin increases liver damage in a murine model of liver injury from alpha-1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 44 (4), 976-982 (2006).
- Heinrich, S., et al. Partial bile duct ligation in mice: a novel model of acute cholestasis. Surgery. 149 (3), 445-451 (2011).
- Glaser, S. S., Alpini, G. Activation of the cholehepatic shunt as a potential therapy for primary sclerosing cholangitis. Hepatology. 49 (6), 1795-1797 (2009).
- Gurpinar, E., et al. A novel sulindac derivative inhibits lung adenocarcinoma cell growth through suppression of Akt/mTOR signaling and induction of autophagy. Mol Cancer Ther. 12 (5), 663-674 (2013).
- Alpini, G. G., Francis, H., Marzioni, M., Venter, J., Phinizy, J., LeSage, G. . Madame Curie Bioscience Database. , (2013).
- Kirkland, J. G., et al. Reversible surgical model of biliary inflammation and obstructive jaundice in mice. J Surg Res. 164 (2), 221-227 (2010).
- Delhove, J. M., et al. Longitudinal in vivo bioimaging of hepatocyte transcription factor activity following cholestatic liver injury in mice. Sci Rep. 7, 41874 (2017).
- Li, C., et al. Homing of bone marrow mesenchymal stem cells mediated by sphingosine 1-phosphate contributes to liver fibrosis. J Hepatol. 50 (6), 1174-1183 (2009).
- Xu, J., et al. Factors released from cholestatic rat livers possibly involved in inducing bone marrow hepatic stem cell priming. Stem Cells Dev. 17 (1), 143-155 (2008).
- Sharma, S., et al. Propitious role of bone marrow-derived mononuclear cells in an experimental bile duct ligation model: potential clinical implications in obstructive cholangiopathy. Pediatr Surg Int. 29 (6), 623-632 (2013).
