Summary

Выделение и характеристика нейтрофилов производные микрочастиц для функциональных исследований

Published: March 02, 2018
doi:

Summary

Здесь описываются новые протоколы изолировать и характеризуют микрочастицы, производные от человека и мыши нейтрофилов. Эти протоколы используют ultracentrifugation, проточной цитометрии и immunoblotting методы для анализа содержания микрочастица, и они могут быть использованы для изучения роли микрочастицы, полученных из различных типов клеток в клеточную функцию.

Abstract

Полиморфноядерных нейтрофилов производные микрочастиц (ПМН)-м/с), липидный бислой, сферические микровезикулы с размерами от 50 до 1000 Нм в диаметре. М/с являются недавно развивается, важной частью ячеек для связи и сигнализации машин. Из-за их размера и характера их выпуска до недавнего времени было игнорировать существование MP. Однако с усовершенствованной технологии и аналитические методы теперь становится их функции в здоровье и болезни. Здесь представлены протоколы направленные на изоляцию и характеризующие ПМН-МПС проточной цитометрии и immunoblotting. Кроме того приводятся некоторые примеры реализации. Эти протоколы для изоляции MP быстрый, недорогой и не требует использования дорогих комплектов. Кроме того они позволяют для маркировки депутатов после изоляции, а также предварительно маркировки источник клеток до выпуска MP, используя проточной цитометрии мембраны конкретных Люминесцентную краску для визуализации и анализа. Эти методы, однако, имеют некоторые ограничения, включая чистоты ПНЛ и депутатов и потребность в сложных аналитических приборов. High-end проточный цитометр необходима для надежного анализа м/с и свести к минимуму ложные положительные читает из-за шума или auto флуоресценции. Описанные протоколы могут использоваться для изоляции и определить биогенеза MP и охарактеризовать их маркеры и изменения в составе различных стимулирующих условиях. Размер неоднородность может быть использована расследовать ли содержание частиц мембраны против exosomes отличается, и ли они выполняют различные роли в ткани гомеостаза. Наконец можно изучить следующие изоляции и характеристика депутатов, их функции в клеточных реакций и различных моделей болезни (в том числе, ПМН ассоциированных воспалительных расстройств, таких как воспалительные заболевания кишечника или острого повреждения лёгких).

Introduction

Недавно, «микрочастицы/микровезикулы» возникая от в цитозоле клеток или плазматической мембраны стали большой научный интерес, как новые данные показывают, что эти структуры, начиная от 50-1000 Нм в диаметре, может нести биологической информации и служить неканонических метод сотовой связи. Иммунной клетки производные м/с, и особенно производимые полиморфноядерных нейтрофилов (ПНЛ) представляют большой интерес, учитывая важную роль ПНЛ в принимающей обороны1,2, воспалительные реакции3и заживление ран 4. до настоящего времени, интригующе, многочисленные доклады показали, про воспалительных и противовоспалительным функции ПМН-МПС5, предлагая потенциальным контекст-, болезни-, видов-и органоспецифическая роль депутатов.

Описанные протоколы в этой связи обеспечивают экономически эффективные, инновационные и адаптируемой метод для изучения функции депутатов в здоровье и болезни. Они применимы для многих модельных организмов, органов и стимуляции условий. Они позволяют для идентификации нескольких типов депутатов и может использоваться в будущем для решения их про воспалительных и противовоспалительными функций. В качестве примера, описанные здесь, как для изучения функции ПМН-депутатов в эпителиальных рану исцеления, в пробирке и в естественных условиях. Представленные протокол для изоляции мыши, костного мозга, полученных ПНЛ был адаптирован с некоторыми изменениями из ранее описанных метод6.

Кроме того, протоколы, описанные в данном исследовании позволяют для обнаружения и определения характеристик определенных маркеров, которые могут быть найдены на ПМН-МПС двумя взаимодополняющими методами: западной помарки и проточная цитометрия. Мы находим, что immunoblotting депутатов, используя стандартные протоколы5 легко и надежно, однако, последние достижения в чувствительность потока цитометрии инструментов и улучшение коэффициента шума на сигнал теперь позволяют для дальнейшего анализа депутатов с помощью этого метода. Описанные протоколы в этом исследовании включать последние достижения и рекомендации от оригинальных научных статей, включая изменения в центрифугирования скорости и времени, помимо условий фильтрации и замораживания/хранения образца7 , 8и как уменьшить «шумы», повысить предел обнаружения ПМН-депутатов и дискриминацию между различными размерами депутатов.

Protocol

Все животные работы был одобрен северо-IACUC. Все эксперименты были завершены в соответствии и соблюдение всех соответствующих нормативных и институциональных руководящих принципов. Для сдачи донорской крови человека предметов осознанного согласия был представлен и подписано; Кроме т?…

Representative Results

Анализ представительных потока гранулярных депутатов, которые были изолированы от человека и мыши ПНЛ показаны на рисунке 1. Размер неоднородность ПМН-депутатов могут быть оценены путем сравнения для известных размера бусин, как показано на <strong class="xfi…

Discussion

В этом сообщении описываются протоколы изоляции и характеристика ПМН производные депутатов. Для успешного проведения процедуры необходимо учитывать несколько ключевых критических точек. Во-первых ПНЛ должен быть изолирован свежие и используется в экспериментах в течение 2 ч изоляци?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны за технической помощи Сваминатана Сучитра доктора, который проходит северо-Фейнберг Школа из медицины потока цитометрии ядро. Финансирование было предоставлено DK101675 (НИЗ).

Materials

DMEM Corning 10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) Atlanta Biologics S11150
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140
0.5 M EDTA Fisher BP2482
Sodium chloride Sigma S9888 Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit
Sterile filtered Histopaque 1077 Sigma 10771
Sterile filtered Histopaque 1119 Sigma 11191 Density 1.119 g/ml.  Solution of polysucrose and  sodium diatrizoate. Bring to room temperature
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium Cellgro 210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof) Decon labs 2701
HBBS Corning 21-022-CV
Trypan Blue Solution, 0.4% Sigma T8154 SIGMA Diluted 1:2 for cell viability counting
Isoflurane Abbot 50033
Anti-human CD11b-APC conjugated Biolegend 301350 Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL)
BODIPY FL Invitrogen B10250 N-(2-aminoethyl) maleimide 
Annexin V Binding Buffer Biolegend 422201
Calibration Beads for Flow Cytometry BioCytex 7803
FITC Annexin V Biolegend 640906
Polymorphprep Axis-Shield PoC AS Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml
C57BL/6 mice Jackson Labs
15 ml centrifuge tubes Corning 430053
50 ml centrifuge tubes BD Falcon 352070
25 ml serological pipettes Celltreat 229225B
10 ml serological pipettes Celltreat 229210B
5 ml serological pipettes Celltreat 229205B
Pasteur pipettes  BD Falcon 357575
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) BD 305122
100 µm cell strainers Celltreat 229485
Vacutainer tubes BD 367251
Equipment
LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) BD (SORP)
Swinging bucket centrifuge ThermoFisher Scientific 75007210
Ultracentrifuge Beckman (L8-80 M)
Micro-centrifuge ThermoFisher Scientific  VV-17703-15 (Fresco 17)
Swinging bucket centrifuge ThermoFisher Scientific  75004503 (Megafuge 40R)
Biopsy forceps, 28 cm Storz 27071zj
Software
Image J National Institute of Health Open source 

References

  1. Hickey, M. J., Kubes, P. Intravascular immunity: the host-pathogen encounter in blood vessels. Nat Rev Immunol. 9 (5), 364-375 (2009).
  2. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat Rev Immunol. 6 (3), 173-182 (2006).
  3. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  4. Butin-Israeli, V., et al. Deposition of microparticles by neutrophils onto inflamed epithelium: a new mechanism to disrupt epithelial intercellular adhesions and promote transepithelial migration. FASEB J. , (2016).
  5. Gasser, O., Schifferli, J. A. Activated polymorphonuclear neutrophils disseminate anti-inflammatory microparticles by ectocytosis. Blood. 104 (8), 2543-2548 (2004).
  6. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
  7. Shet, A. S. Characterizing blood microparticles: technical aspects and challenges. Vasc Health Risk Manag. 4 (4), 769-774 (2008).
  8. Dey-Hazra, E., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vasc Health Risk Manag. 6, 1125-1133 (2010).
  9. Slater, T. W., et al. Neutrophil Microparticles Deliver Active Myeloperoxidase to Injured Mucosa To Inhibit Epithelial Wound Healing. J Immunol. 198 (7), 2886-2897 (2017).
  10. Enjeti, A. K., Lincz, L., Seldon, M. Bio-maleimide as a generic stain for detection and quantitation of microparticles. Int J Lab Hematol. 30 (3), 196-199 (2008).
  11. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Sci Transl Med. 7 (315), (2015).
  12. Andersson, T., Dahlgren, C., Lew, P. D., Stendahl, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of phorbol myristate acetate. J Clin Invest. 79 (4), 1226-1233 (1987).

Play Video

Cite This Article
Finkielsztein, A., Mascarenhas, L., Butin-Israeli, V., Sumagin, R. Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e56949, doi:10.3791/56949 (2018).

View Video