In Vivo Trasferimento del gene per l'endotelio dell'arteria carotica comune di coniglio

Summary

Questo metodo è quello di introdurre un transgene nell’endotelio delle arterie carotiche coniglio. Introduzione del transgene permette di valutare il ruolo biologico del prodotto transgene in arterie normali o modelli di malattia. Il metodo è anche utile per misurare l’attività di sequenze regolatrici del DNA.

Abstract

L’obiettivo di questo metodo è quello di introdurre un transgene nell’endotelio dei segmenti isolati di entrambe le arterie carotiche comuni di coniglio. Il metodo raggiunge focale transgenesi endoteliale selettivo, consentendo in tal modo un investigatore per determinare i ruoli biologici di transgeni endoteliale-espresso e quantificare l’attività trascrizionale in vivo delle sequenze di DNA in grande arteria cellule endoteliali. Il metodo utilizza isolamento chirurgico delle arterie carotiche comuni di coniglio e un’arteriotomia per consegnare un vettore virale che esprimono transgene interno del lume arterioso. Un periodo di incubazione breve del vettore nel lume, con successiva aspirazione del contenuto lumen, è sufficiente per realizzare efficiente e durevole espressione del transgene nell’endotelio, con nessun rilevabile trasduzione o espressione di fuori della segmento arterioso isolato. Il metodo consente la valutazione delle attività biologiche del transgene prodotti sia in arterie normali modelli di malattia vascolare umano, evitando effetti sistemici che potrebbero essere causati da targeting genico ad altri siti (ad es. il fegato) o per l’approccio alternativo di erogare costrutti genetici all’endotelio di transgenesi linea germinale. Applicazione del metodo è limitata dalla necessità di un chirurgo esperto e anestesista, una ben attrezzata sala operatoria, i costi di acquisto e alloggiamento conigli e la necessità di esperienza nella costruzione di vettore di trasferimento genico e uso. Risultati ottenuti con questo metodo includono: alterazioni relative transgene in struttura arteriosa, cellularità, matrice extracellulare o funzione vasomotore; aumenti o riduzioni di infiammazione arteriosa; alterazioni nell’apoptosi delle cellule vascolari; e progressione, ritardo o regressione di malattie come l’iperplasia intimale o aterosclerosi. Il metodo consente inoltre di misurare la capacità di nativi e sintetici sequenze regolatrici del DNA per alterare l’espressione del transgene in cellule endoteliali, fornendo risultati che includono: livelli di transgene mRNA, i livelli di proteina transgene e livelli di transgene attività enzimatica.

Introduction

L’obiettivo di questo metodo è quello di introdurre un transgene nell’endotelio delle arterie carotiche comuni di coniglio. Introduzione del transgene permette di valutare il ruolo biologico del prodotto transgene sia in arterie normali modelli di coniglio della malattia arteriosa umana. La sovraespressione del transgene in modelli di malattia può rivelare se il transgene (e il suo prodotto proteico) mostrano la promessa come agenti terapeutici^1,2,3,4. Inclusione di elementi regolatori cis-acting in cassetta di espressione del transgene consente la valutazione dell’attività di questi elementi nell’endotelio arterioso in vivo^5,6. Conoscenza dell’attività di specifici elementi regolatori cis-agenti può essere utilizzato per progettare cassette di espressione più attivi e per sondare i meccanismi di regolazione genica in grande arteria endotelio in vivo⁷.

I conigli sono un modello valido per vari aspetti della fisiologia vascolare umana e malattia. Conigli condividono molte caratteristiche vascolari con gli esseri umani. Ad esempio, valori ematologici basali, regolamento emostatico e vascolare tensione longitudinale sono simili tra conigli e gli esseri umani⁸. Modelli di coniglio di malattie vascolari replicano le caratteristiche principali di molte malattie umane, inclusi: aneurismi (simili caratteristiche di flusso e geometrici)⁹, vasospasmo (simile risposta a trattamento endovascolare)^10,11, e aterosclerosi (placche intimal con caratteristiche simili, tra cui un nucleo ricco di lipidi, macrofagi e cellule muscolari lisce in un cappuccio fibroso)^12,13. Di conseguenza, sono stati sviluppati modelli di coniglio per molte malattie vascolari come trombosi, vasospasmo, aneurisma, diabete, stenosi vascolare dell’innesto e aterosclerosi^{8,13,14, 15,16}.

Per i ricercatori scegliendo tra modelli animali di fisiologia vascolare e nella malattia, il coniglio ha diversi vantaggi. Rispetto ai roditori, i battelli più grandi dei conigli permettono più facile manipolazione chirurgica, uso di dispositivi endovascolari e una maggiore quantità di tessuto per le misure quantitative. I conigli sono molto più vicini filogeneticamente ai primati che sono roditori¹⁷, e la maggiore diversità genetica dei conigli nazionali meglio approssima la variabilità genetica degli esseri umani. Diversità genetica è particolarmente importante per gli studi preclinici, che-per loro natura-obiettivo di sviluppare terapie che possono essere applicate alla popolazione umana geneticamente diversa. Come con molti se non tutti gli altri specie modello, geni di coniglio sono facilmente clonati o sintetizzati perché è stato sequenziato il genoma di coniglio con alta copertura (7,48 x) [http://rohsdb.cmb.usc.edu/GBshape/cgi-bin/hgGateway?db=oryCun2]. Rispetto ad altri modelli animali grandi (ad esempio, cani, maiali o pecore), i conigli sono relativamente poco costosi da acquistare e casa e sono più facili da allevare e gestire. Modelli specifici di malattia vascolare in conigli ogni hanno i loro vantaggi e difetti come modelli di malattia umana che esulano dall’ambito di questo manoscritto^8,12,18. Un investigatore dovrebbe rivedere questi vantaggi e difetti per determinare se il coniglio è il modello migliore per rispondere ad una domanda specifica sperimentale.

Introduzione di sequenze regolatrici di acido desossiribonucleico (DNA) in cellule endoteliali in vivo consente di indagine dell’attività di queste sequenze in un ambiente fisiologico complesso. Studi in vitro in cellule trasfettate endoteliale possono essere utile per la valutazione iniziale delle sequenze regolatrici del DNA; Tuttavia, i livelli di espressione in modelli di coltura del tessuto a volte non vengono riprodotti quando gli studi sono ripetute in vivo^5,19,20. Sistemi in vitro possono anche essere utili per esplorare la base delle vie di segnalazione proteica e la fisiologia endoteliale, nonché comunicazione tra cellule vascolari coltivate; Tuttavia, le vie più complesse o reti di regolazione che sono influenzati da complesse popolazioni di cellule vascolari vicine o il sistema immunitario migliore sono studiate in un in vivo sistema^6,20. Il metodo descritto nel presente documento fornisce una piattaforma per esplorare la regolazione dell’espressione del transgene nell’endotelio nel contesto di una nave intatta, con o senza malattia. Il sistema in vivo permette anche indagine di crosstalk cellular fisiologiche e patologiche e l’identificazione dei contributi del sistema immunitario alla regolazione del gene espressione⁶.

Germe-linea transgenesi (soprattutto nei topi) sono un approccio alternativo per dirigere l’espressione del transgene alle cellule endoteliali. Questo approccio può fornire l’espressione del transgene tutta la vita, con il targeting endoteliale mediata da specifici promotore o regioni regolative^21,22. Tuttavia, la generazione di topi transgenici è lungo e costoso, diverse linee transgeniche devono essere spesso testati per garantire il targeting del transgene per il tipo di cella desiderata e il raggiungimento dei livelli di espressione del transgene adeguata e sperimentale Risultati in sistemi murini possono essere ceppo-dipendente. Modelli murini transgenici con transgeni endoteliale-mirati hanno molti vantaggi: non c’è alcuna necessità di eseguire un intervento chirurgico su ogni animale sperimentale al fine di raggiungere la transgenesi, topi sperimentali possono essere allevati con numerosi altri topi transgenici disponibili in ordinare per testare interazioni genetiche e fenotipiche, e c’è una vasta selezione di anticorpi che reagiscono con le proteine murine, facilitando la caratterizzazione dei fenotipi. Tuttavia, targeting di transgeni all’endotelio tramite la linea germinale in genere comporta l’espressione del transgene in tutto il sistema vascolare,²² rende difficile determinare il sito in cui agisce il prodotto del transgene. Questo è particolarmente vero quando il prodotto del transgene è secreto, perché un transgene prodotto secernuto dalle cellule endoteliali in tutto il sistema vascolare potrebbe avere attività biologica in un numero qualsiasi di siti all’interno di un animale. Anche se il metodo descritto in questo manoscritto richiede competenze tecniche e strutture specializzate, può essere molto meno tempo e meno costoso di sviluppare una linea di topi transgenici endoteliali specifici. Esso consente la valutazione della funzione di una proteina selettivamente nelle cellule endoteliali di un segmento di grande arteria, e permette l’uso della carotide comune controlaterale come controllo appaiato (eliminando i fattori sistemici che possono variare tra sperimentale animali-ad esempio, la pressione sanguigna o livelli di colesterolo-come variabili incontrollate).

La terapia genica è un approccio promettente per il trattamento delle malattie vascolari, malattie croniche in particolare, perché una singola applicazione in grado di fornire sostenuta o forse tutta la vita l’espressione di un gene terapeutico²³. La promessa terapeutica della terapia genica è stata esplorata in modelli animali di trasferimento genico somatico, spesso il fegato^24,25, che è un obiettivo relativamente facile perché molti vettori virali ematica sono hepatotropic di targeting. Tuttavia, per avere un effetto sulla malattia vascolare, terapia genica mirata al fegato dovrà raggiungere sistemica iperespressione delle proteine. Ciò richiede in genere grandi dosi di vettore, che può essere tossico o addirittura mortali²⁶. Inoltre, ha aumentato i livelli sistemici di un aumento di proteine, il rischio di effetti collaterali fuori bersaglio, che potrebbe complicare o oscurare anche interpretazione dei risultati sperimentali. Terapia genica locale targeting endotelio vascolare come descritto in questo manoscritto potrebbe evitare effetti collaterali sistemici perché il vettore infuso non è ampiamente diffusi oltre il segmento arterioso trasdotte, e gli effetti vascolari locali possono essere realizzati senza cambiamenti nei livelli di plasma sistemica della proteina. ²⁷ inoltre, è necessaria una quantità nettamente inferiore di vettore di trasdurre un segmento arterioso in quanto è necessario per raggiungere robusto trasduzione epatica. L’espressione del transgene dal fegato è stata segnalata a diminuire nel tempo, probabilmente a causa del turnover cellulare, che richiedono dosi ripetute se l’espressione del transgene ad alto livello deve essere mantenuta. ²⁸ al contrario, il tasso di turnover basso dell’endotelio fornisce espressione stabile per almeno 48 settimane in conigli alimentati chow e per almeno 24 settimane in lesioni aterosclerotiche dei conigli di colesterolo-federazione. ^{1 , 27}

Per determinare se questo metodo di trasferimento del gene ad endotelio carotica comune coniglio è appropriato, i vantaggi e gli svantaggi (tabella 1) dovrebbero essere considerati nel contesto degli obiettivi specifici di ricerca. I vantaggi di questo metodo includono: conigli nazionali sono maggiormente rappresentativo della diversità genetica umana che sono topi inbred (importanti per lavoro preclinico); conigli forniscono più grandi vasi per manipolazione più facile e più tessuto per l’analisi; l’espressione del transgene mirati dell’endotelio può raggiungere il metodo molto più rapidamente di quanto non germe-linea endoteliale di targeting in topi transgenici; dose di vettore può essere facilmente regolata a livelli variabili di modello di espressione del transgene; è possibile analizzare i processi specifici di grande arteria endotelio; e transgenesi vascolare locale permette la carotide opposta nello stesso animale per essere utilizzato come controllo, eliminando i fattori sistemici come variabili incontrollate. Gli svantaggi includono: speciali strutture e competenze sono necessarie; Sfondi meno geneticamente modificati su cui sperimentare sono disponibili in conigli che nei topi; e c’è una selezione meno estesa di anticorpi di coniglio contro proteine del topo (per immunodetection di transgene proteina ed altri antigeni che possono essere importanti nell’interpretazione dei risultati sperimentali).

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dall’Università di Washington Office of Animal Welfare e associato istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) e sono stati completati in conformità e rispetto di tutte le pertinenti normative e istituzionali linee guida. Nota: Il trasferimento del Gene ad arterie carotiche comuni coniglio viene eseguita sui conigli da un chirurgo con l’ausilio di un anestesista o un assistente. 1. trasferimento del Gene per le arterie carotiche comuni di coniglio: pr…

Representative Results

Per implementare questo metodo con fiducia, esperimenti preliminari sono necessari per stabilire che l’operatore realizza trasferimento genico efficiente e riproducibili, con l’espressione del transgene principalmente in cellule endoteliali luminal. Nella nostra esperienza, questo è più facilmente valutato usando un vettore che esprime la β-galattosidasi. 5-bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-Galactopyranoside (X-gal) la macchiatura dei segmenti carotiche comune rimosso 3 giorni dopo infusio…

Discussion

Alcuni aspetti della tecnica chirurgica meritano un’attenzione particolare. Esposizione completa e mobilizzazione dell’arteria carotica comune tramite la dissezione attenta volontà facilitare gene transfer e arteriotomia riparazione. Tuttavia, durante la dissezione, manipolazione diretta dell’arteria carotica dovrebbe essere minimizzato per impedire il vasospasmo. Inoltre, qualsiasi sanguinamento adiacente all’arteria deve essere interrotto applicando una leggera pressione con una garza e sangue travasato deve essere ri…

Materials

Disposables
3mL syringe with 24G needle	Becton Dickinson	309571	2x for gene transfer surgery; 3x for harvest surgery
1mL syringe with 27G needle	Becton Dickinson	309623	6x for gene transfer surgery; 1x for harvest surgery
20mL syringe, luer lock	Nipro Medical Corp	JD+20L
Catheters, 24G x 3/4"	Terumo Medical Products	SROX2419V
19G needle	Becton Dickinson	305187	Gene transfer surgery only
21G needle	Becton Dickinson	305165	For 20 mL syringe of saline
Gauze 4" x 4"	Dynarex	3242	~10-15 per surgery
3-0 silk suture	Covidien Ltd.	S-244
5-0 silk suture	Covidien Ltd.	S-182	Gene transfer surgery only
7-0 polypropylene suture	CP Medical	8648P	Gene transfer surgery only
5-0 polyglycolic acid suture	CP Medical	421A	Gene transfer surgery only
3-0 polyglycolic acid suture	CP Medical	398A	Gene transfer surgery only
Alcohol swabs	Covidien Ltd.	6818	For placement of I.V. line
Catheter plug	Vetoquinol	411498	Gene transfer surgery only
Ketamine HCl, 100 mg/mL	Vedco Inc.	05098916106
Xylazine, 100 mg/mL	Akorn Inc.	4821
Lidocaine HCl, 2%	Pfizer	00409427702
Bupivacaine HCl, 0.5%	Pfizer	00409161050
Beuthanasia D-Special	Intervet Inc.	NDC 00061047305	Harvest surgery only
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL	Patterson Veterinary	12496075705	Gene transfer surgery only
Saline IV bag, 0.9% sodium chloride	Baxter	2B1309	2x for gene transfer surgery; can use vial of sterile saline in place of one
Heparin  (5000 U/mL)	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-047-10	Gene transfer surgery only
Fentanyl patch, 25 mcg/hr	Apotex Corp.	NDC 60505-7006-2	Gene transfer surgery only
Isoflurane	Multiple vendors	Catalog number not available
Gene transfer vector			Dilute 350 µL per artery; 2 x 1011 vp/mL for adenovirus; gene transfer surgery only
Surgical Instruments
Metzenbaum needle holder 7" straight	Roboz	RS-7900	Gene transfer surgery only
Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt	Roboz	RS-6828
Needle holder /w suture scissors	Miltex	8-14-IMC	Gene transfer surgery only
Castroviejo scissors	Roboz	RS-5658
Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock	Roboz	RS-6412	Gene transfer surgery only
Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt	Roboz	RS-5943
Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs	Roboz	RS-6514	2x
Backhaus towel clamp 3.5"	Roboz		4x
Micro clip setting forceps 4.75"	Roboz	RS-6496	Gene transfer surgery only
Micro vascular clips, 11 mm	Roboz		2x for gene transfer surgery only
Surg-I-Loop	Scanlan International	1001-81M	5 cm length
Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width	Roboz	RS-5210
Dumont #3 forceps Inox tip size .17 X .10mm	Roboz	RS-5042
Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8mm tip	Roboz	RS-5280
Halstead mosquito forceps,  5" straight, 1.3mm tips	Roboz	RS-7110	2x
Halstead mosquito forceps,  5" curved, 1.3mm tips	Roboz	RS-7111
Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips	Roboz	RS-7117
Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips	Roboz	RS-7305
Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width	Roboz	RS-8162
Allis-Baby forceps, 12 cm, 4×5 teeth, 3 mm tip width	Fine Science Tools	11092-12	2x
Adson forceps, 12 cm, serrated, straight	Fine Science Tools	11006-12
Veterinary electrosurgery handpiece and electrode	MACAN Manufacturing	HPAC-1; R-F11
Surgical Suite Equipment
Circulating warm water blanket and pump	Multiple vendors	Catalog number not available
Forced air warming unit	3M	Bair Hugger Model 505	Gene transfer surgery only
IV infusion pump	Heska	Vet IV 2.2	Gene transfer surgery only
Isoflurane vaporizer and scavenger	Multiple vendors	Catalog number not available
Veterinary multi-parameter monitor	Surgivet	Surgivet Advisor
Veterinary electrosurgery unit	MACAN Manufacturing	MV-9
Surgical microscope	D.F. Vasconcellos	M900	Needs ~16x magnification