Терапия, тестирование в модели культуры на основе сфероида 3D клеток для головы и шеи плоскоклеточный рак
Summary
Мы описываем эволюции на основе сфероида, трехмерный в vitro модель, которая позволяет нам проверить текущий стандарт экспериментальной терапии схем для головы и шеи плоскоклеточный рак на клеточных линий, направленных на оценку терапии восприимчивость и сопротивления на первичной клетки от человеческих образцов в будущем.
Abstract
Текущие варианты лечения для продвинутых и рецидивирующий головы и шеи плоскоклеточный рак (HNSCC) заключить излучения и химио лучевой подходы с или без хирургического вмешательства. Хотя схемы химиотерапии на основе платины в настоящее время представляют золотой стандарт с точки зрения эффективности и даны в подавляющем большинстве случаев, новых схем химиотерапии, а именно появляются иммунотерапии. Однако трудно предсказать и остаются недостаточно понятны ответов и терапии сопротивление механизмы либо режим химиотерапии. На сегодняшний день известны широкие вариации химиотерапии и радиационной механизмов сопротивления. Это исследование описывает разработку стандартизированных, высокой пропускной способности в vitro пробирного оценить ответ HNSCC клеточной линии для различных схем терапии и, надеюсь, на первичной клетки от отдельных пациентов как инструмент будущего для персональной опухоли терапии. Assay предназначен для интеграции в стандартный алгоритм контроля качества для HNSCC пациентов в нашем центре третичной медицинской помощи; Однако это будет предметом будущих исследований. Техническая осуществимость выглядит многообещающим для начальных ячеек от биопсии опухоли от фактической пациентов. Затем образцы передаются в лабораторию. Биопсия механически отделены следуют ферментативного пищеварения. Клетки затем культивировали в ультра-низкой адгезии клеток культуры флаконов, способствующих воспроизводимость, стандартизированных и спонтанного формирования Трёхмерный, сфероид образной ячейки конгломератов. Сфероидов затем готовы быть подвержены химио лучевой протоколы и протоколы иммунотерапия при необходимости. Окончательный размер жизнеспособность и сфероида показатели восприимчивости терапии и поэтому может быть втянутыми в рассмотрение в будущем для того, чтобы оценить ответ вероятно терапии пациентов. Эта модель может быть ценным, экономически эффективным инструментом к персонализированной терапии рака головы и шеи.
Introduction
Голова и шея плоскоклеточный рак (HNSCC) является шестым наиболее распространенных рака во всем мире с ростом случаев инфицирования слизистой оболочки вируса папилломы человека (ВПЧ) инфекции связанные патогенеза, рядом с большинством случаев, вызванных чрезмерным никотина и алкоголя потребление 1,2. Хотя небольшие опухоли и неинвазивного этапов, как правило, хорошо поддается лечению с хирургическое иссечение, обычно в сочетании с шейки матки лимфодиссекции, лечение для расширенного этапа и рецидивирующий HNSCC остается сложным из-за вторжения агрессивным опухоль с Метастатические распространение и устойчивость к радиации и химиотерапии протоколы3,4,5,6,,78. Недавние исследования показывают высокую изменчивость клеточном фенотипу и суб характеристика циркулирующих и распространение раковых клеток только начался9,10. Ранее вера твердых, форма опухоли массы пришлось пересмотреть в свете последних исследований в прошлом лет11,12,13,14. Нынешние подходы для характеристики опухоли и выявление ключевых мутаций может определить несколько генов, которые, кажется, быть связаны с терапии сопротивление, но остаются дорогостоящих подход. Кроме того знание генотип не обязательно позволяют надежное прогнозирование фенотипа и его лечение реакции.
Там было несколько достижений в улучшении общей и безрецидивной выживаемости для расширенный этап и повторяющихся болезней. Никотин – а также связанные вирус карциномы текущие варианты лечения Помимо хирургии заключите агрессивной радиационной и химиотерапии на основе платины схемы. Там были последствия для различных ответов между ВПЧ отрицательных и положительных карцинома; Однако это еще не приведет к изменению в целом руководящие принципы терапии. Устойчивость к радиации и химиотерапии является широко распространенным явлением во всех стадиях опухоли и существует на основе платины химиотерапии также, как для целенаправленной терапии (анти-EGFR; рецептор эпидермального фактора роста) и недавно новые ингибирование контрольно-пропускного пункта15. Неэффективные лучевой и химиотерапии приходят высокой ценой значительных пациента заболеваемости с точки зрения дисфагии, мукозит, сухость во рту и риск снижения функции почек или сердца среди других. Прогнозирование терапии реакции предварительное решение концепции общей терапии для каждого отдельного пациента, как представляется, решающую цель, предотвращая концепции ненужных лечения, побочные эффекты и расходы.
Мы стремились создать модель для проверки конкретного пациента лечение восприимчивость к текущей стандартной химио излучения, которые могут быть интегрированы в регулярных и контролем качества онкологического лечения алгоритм с точки зрения технической стоя. Далеко целью было использовать модель без использования сильно изменены и возрасте клеточных линий, как плохо они представляют собой фактические человека опухолевых клеток без их изменчивости и неоднородности, как мы знаем теперь, при создании протокола было сделано в различных клеточных линий. Быть независимым только от коммерчески доступных клеточных линий, мы недавно успешно созданы промежуточные клетки линии, называется «Пика» от первичных клеток HNSCC от человека опухоли образцов с сохранение клеточных маркеров на его поверхности и ограниченные отрывки 16. это PiCa клеточной линии должны служить подготовка к разработке модели на дороге к позже после испытания с свежими человеческих раковых клеток с биопсий опухоли. Было показано, что клетки в трехмерной клеток культур по-разному реагируют и более в естественных условиях-как для отправления рака наркотиков, чем тех, кто растет в монослои17,18,19,20 ,21, главным образом благодаря сохранению мигрирующих и суб дифференциация свойств определенных ячеек подмножеств22,23,24. Здесь мы описываем протокол на основе сфероида, трехмерные модели из промежуточных клеточных линий и первичного человека плоскоклеточный рак ячейки и способы как интегрировать такую модель в лечение рака головы и шеи хирург, онколог ( Рисунок 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы смогли установить протокол для создания воспроизводимых сфероидов из клеточных суспензий, для обеих линий клетки и в предварительных экспериментов, клетки первичной опухоли человека. Мы сначала оценить два ранее описанных методов и определили Ула метод, где используются культуры ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался Грант из университета Мюнхена (FöFoLe проекта no.: 789-781).
Materials
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters’ significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies?. PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
