Summary

Colección de tejido adiposo ratón y procesamiento para el análisis de ARN

Published: January 31, 2018
doi:

Summary

El objetivo de este trabajo es presentar un procedimiento paso a paso para recoger diferentes tejidos adiposos blancos de ratones, procesar las muestras de grasa y extracto de RNA.

Abstract

En comparación con otros tejidos, tejido adiposo blanco tiene un contenido considerablemente menos RNA y proteína para aplicaciones posteriores como PCR en tiempo real y Western Blot, ya que en su mayoría contiene lípidos. Aislamiento de RNA de las muestras de tejido adiposo también es un reto como pasos adicionales son necesarios para evitar estos lípidos. Aquí, presentamos un procedimiento para recoger tres anatómicamente diferentes blancos los tejidos adiposos de los ratones, para procesar las muestras y realizar aislamiento de RNA. Además describimos la síntesis del cDNA y del gene experimentos de expresión usando PCR en tiempo real. El protocolo aquí descrito permite la reducción de la contaminación de pelo y sangre en almohadillas de grasa, así como la contaminación cruzada entre diferentes cojines gordos durante la recogida de tejido del animal. También se ha optimizado para garantizar la adecuada cantidad y calidad del ARN extraído. Este protocolo puede ser ampliamente aplicada a cualquier modelo de ratón donde las muestras de tejido adiposo son requeridas para experimentos de la rutina como PCR en tiempo real pero no está diseñado para el aislamiento de cultivos celulares de adipocitos primarios.

Introduction

La obesidad es una epidemia en todo el mundo que puede conducir a complicaciones tales como tipo 2 diabetes1. Modelos animales obesos y modificados genéticamente inducida por la dieta se utilizan con frecuencia para la investigación en la obesidad y sus complicaciones asociadas. Tradicionalmente, el tejido adiposo blanco es conocido como un compartimiento de almacenamiento para el exceso de energía y sobre todo se compone de lípidos y tejido adiposo marrón convierte la energía en calor2,3. Tejido adiposo es dinámico y ampliará y encogen dependiendo de muchos factores como el consumo de alimentos y actividad física. Por lo tanto, para determinar los factores que contribuyen a estos cambios, manejo y colección adecuada de tejido adiposo son necesarios4.

Entre los blancos de los tejidos adiposos, está generalmente aceptado que los depósitos de grasa subcutáneos y viscerales tienen diferentes propiedades tales como la localización anatómica y función2,5. En consecuencia, para evitar resultados contradictorios o gran variabilidad, atención debe ser tomado para evitar la contaminación cruzada entre los diferentes depósitos de grasa al recoger cojines gordos.

Por otra parte, hay tres grandes retos cuando aislar RNA o proteína del tejido adiposo de ratones blancos. En primer lugar, recogiendo los cojines gordos en ratones obesos no es tarea fácil como la frontera que separa los diferentes depósitos de grasa blanco no siempre es clara, a diferencia de otros órganos como los riñones y el corazón6. En segundo lugar, debido al contenido alto de lípidos del tejido adiposo, durante el aislamiento de ARN o proteína, una capa de lípidos flota en la parte superior y evita el acceso directo a la muestra. En tercer lugar, a diferencia del tejido adiposo marrón u otros tejidos, tejido adiposo blanco tiene mucho menor contenido de RNA y proteínas y esto es de gran preocupación al usar ratones jóvenes, ratones alimentaron con una dieta normal (N) y ratones que tienen masas de grasa bajo (es decir, KO modelos, tratamiento con fármacos, ejercen entrenamiento, etcetera.) 7 , 8.

Por lo tanto, es fundamental elegir el método adecuado para aislar el ARN del tejido adiposo. Métodos alternativos a la extracción de fenol/cloroformo son kits comerciales. Se basan típicamente en un paso de extracción de fenol inicial, seguido de purificación de RNA en una columna9. Sin embargo, los kits son típicamente más caros y dan muestras de menor rendimiento, mientras que la calidad del RNA puede ser variable pero mucho menos tiempo. Sin embargo, una de las mayores ventajas para la extracción del fenol/cloroformo solución descrita aquí es la posibilidad de aislar RNA, DNA y proteína de una sola muestra de10. Desde cojines gordos ratones son generalmente pequeñas y dan pequeñas cantidades de RNA y proteínas (especialmente en modelos de ratón magro), estos protocolos maximizan los datos que uno puede salir de una pequeña muestra.

El objetivo de este trabajo es describir detalladamente un método para garantizar la obtención adecuada de depósitos de tejido adiposo blanco tres ratones, así como cantidad y calidad de aislamiento de RNA. RNA obtenido siguiendo este protocolo se puede utilizar para realizar análisis PCR en tiempo real. Este protocolo no está diseñado para el aislamiento de RNA de adipocitos cultivados de primarias.

Protocol

Cuidado de los ratones utilizados en los procedimientos de cumplimiento de normas para el cuidado y uso de animales de experimentación establecida por el Consejo Canadiense para la protección de los animales. Todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de cuidado Animal y uso en el centro de investigación CHUM. 1. autopsia y colección de tejido adiposo de los ratones macho Hacer grupos experimentales según objetivos del estudio. En este estudio, se recolectaron …

Representative Results

Siguiendo el procedimiento de necropsia, tres tejidos adiposo blanco fueron recogidos y ponderados de los dos grupos de ratones (N y HF alimentados con dieta). Como era de esperar, ratones en la dieta HF habían aumentado peso final y ganancia de peso en comparación con hermanos de camada en dieta de N (tabla 1). Estas observaciones fueron acompañadas por más de un aumento de 2 dobleces en el peso de la PGF, el PRF y el SCS en ratones obesos en comparación con aquello…

Discussion

Siguiente HF-dieta alimentación, encontraron a ratones obesos tengan más cuerpo y peso del tejido adiposo blanco en comparación con ratones alimentados con una dieta de N. RNA extraído con fenol solución rindió muestras de buena pureza. La leptina es un adipoquinas producidas principalmente por el tejido adiposo y se sabe que correlacionan positivamente con la masa grasa16. Como se esperaba, la expresión de mRNA de leptina aumentó en ratones obesos en concomitancia con su masa grasa.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por Canadá de Diabetes.

Materials

1 mL seringes
1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0)
22 G needles
26 G needles
75% Ethanol
Block heater (dry bath)
Chloroform Sigma C2432-500mL
dATP    Thermo scientific R0141
dCTP   Thermo scientific R0151
dGTP   Thermo scientific R0161
DNase I (1 U/µl)  Thermo scientific EN0521
dTTP  Thermo scientific R0171
Faststart Universal SYBR green Master (Rox) Roche 4913922001
Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye  Roche 4913914001
Filtered tips
Forceps  Instrumentarium HB275
Gauze
Hammer
High fat rodent diet Bio-Serv, Frenchtown, NJ F3282
Isopropanol  Laboratoire MAT IH-0101
Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM
Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM
Liquid nitrogen
Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) Thermo scientific EP0742
Nanopure water (referred as ultrapure water)
Nitrile examination gloves
Nitrile gloves
Normal rodent diet Harlan Laboratories, Madison, WI Harlan 2018
P1000 pipetman
P2 pipetman
P20 pipetman
P200 pipetman
Phenol solution (TRIzol)  Ambion Life Technologies 15598018
Pre-identified aluminium foil
Quartz spectrophotometer cuvette
Rack for PCR tube strips
Racks for RT-PCR tube strips
Random hexamers  Invitrogen 58875
Real-time PCR Rotor Gene system  Corbett research RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler
Refrigerated bench-top centrifuge
RiboLock RNase Inhibitor  Thermo scientific EO0381
RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes
RNase-free 1.5 mL screw cap tubes
RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps
RNase-free water  Hyclone SH30538.02
RT-PCR machine Qiagen Rotor-Gene Corbett 3000
RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps
S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM
S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM
Spectrophotometer Biochrom Ultrospec 3100 pro
Stainless steel mortar and pestle
Surgical pads Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad
Surgical scissors  Intrumentarium 130.450.11
Thermal cycler
Thermal cycler  Biometra Thermocycler
Vortex mixer
Weighing spatula

References

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Cite This Article
Tan, P., Pepin, É., Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. J. Vis. Exp. (131), e57026, doi:10.3791/57026 (2018).

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