Muis adipeus weefsel verzameling en verwerking voor RNA analyse
Summary
Het doel van deze paper is te presenteren een stapsgewijze procedure voor het verzamelen van verschillende witte vetweefsel van muizen, de vet monsters te verwerken en extraheren van RNA.
Abstract
Vergeleken met andere weefsels, heeft witte vetweefsel een aanzienlijk minder RNA en eiwit gehalte voor downstream toepassingen zoals real-time PCR en Western Blot, omdat het meestal lipiden bevat. RNA isolatie van adipeus weefselmonsters is ook een uitdaging zoals er extra stappen vereist zijn om te voorkomen dat deze lipiden. Hier presenteren we een procedure voor het verzamelen van drie anatomisch verschillende witte vetweefsel van muizen, voor het verwerken van deze monsters en uitvoeren van RNA isolatie. Verder beschrijven we de synthese van cDNA en gen expressie experimenten met behulp van PCR in real time. De hierbij beschreven protocol staat toe de vermindering van de verontreiniging van de haren en bloed op vet pads evenals kruisbesmetting tussen de verschillende dikke pads tijdens weefsel collectie van het dier. Het is ook geoptimaliseerd om ervoor te zorgen voldoende kwantiteit en kwaliteit van het RNA gehaald. Dit protocol kan worden alom toegepast op elk muismodel waar adipeus weefselmonsters nodig voor routinematige experimenten zoals PCR in real time zijn, maar is niet bedoeld voor de isolatie van de cultuur van de cel van de primaire adipocytes.
Introduction
Obesitas is een wereldwijde epidemie die tot complicaties, zoals type 2 diabetes1 leiden kan. Zwaarlijvig en genetisch gemodificeerde voeding-geïnduceerde dierlijke modellen worden vaak gebruikt voor onderzoek in de obesitas en zijn bijbehorende complicaties. Traditioneel, witte vetweefsel is bekend als een opbergvak voor overtollige energie en bestaat meestal uit lipiden terwijl bruin vetweefsel energie in warmte2,3 omzet. Vetweefsel zal is dynamisch en uitbreiden en verkleinen afhankelijk van vele factoren zoals de voedselinname en lichaamsbeweging. Vandaar, om te bepalen bijdragende factoren aan deze veranderingen, voldoende adipeus weefsel collectie en behandeling zijn vereist4.
Onder witte vetweefsel, is het algemeen aanvaard dat onderhuids en viscerale vet depots verschillende eigenschappen zoals anatomische lokalisatie hebben en functie van2,5. Dus, om te voorkomen dat tegenstrijdige resultaten of grote variabiliteit, aandacht zouden worden genomen om te voorkomen van kruisbesmetting tussen deze verschillende vet depots bij het verzamelen van vet pads.
Bovendien zijn er drie grote uitdagingen bij het isoleren van RNA of eiwit uit muizen witte adipeus weefsel. Ten eerste is verzamelen vet pads in zwaarlijvige muizen niet een gemakkelijke taak als de grens die scheidt van verschillende wit vet depots niet altijd duidelijk, in tegenstelling tot andere organen zoals de nieren en hart6 is. Ten tweede, vanwege het hoge vetgehalte van vetweefsel, tijdens RNA of eiwit isolatie, een laag van lipiden boven en directe toegang tot het monster verhindert. Ten derde, in tegenstelling tot bruin vetweefsel of andere weefsels, witte vetweefsel heeft aanzienlijk lager RNA en eiwit gehalte en dit is van groot belang bij het gebruik van de jonge muizen, muizen gevoed een normale (N) dieet en muizen die naar verwachting hebben lage vet massa (d.w.z. KO modellen, behandeling met geneesmiddelen, oefening, opleiding, enz.) 7 , 8.
Dus, het kiezen van de juiste methode om te isoleren van RNA van vetweefsel is essentieel. Alternatieve methoden voor de winning van fenol/chloroform zijn commerciële kits. Ze zijn meestal gebaseerd op een eerste fenol extractie stap, gevolgd door RNA zuivering op een kolom9. Echter, deze kits zijn meestal duurder en geven van monsters van lagere opbrengst, terwijl de RNA-kwaliteit zou variabele maar zijn minder tijdrovend. Een van de grootste voordelen van fenol oplossing/chloroform extractie hier beschreven is echter de mogelijkheid van het isoleren van RNA, DNA en eiwit uit een monster10. Omdat muizen vet pads meestal klein zijn en kleine hoeveelheid RNA en eiwitten (vooral in mager Muismodellen geven), maximaliseren deze protocollen de gegevens die men uit een kleine steekproef krijgen kan.
Het doel van deze paper is om te beschrijven in detail een methode om te zorgen voor adequaat monster collectie van drie muizen witte vetweefsel depots evenals de hoeveelheid en de kwaliteit van RNA isolatie. RNA verkregen door het volgen van dit protocol kan worden gebruikt om uit te voeren real-time PCR-testen. Dit protocol is niet bedoeld voor RNA isolatie van gekweekte primaire adipocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Volgende HF-dieet voeding, zwaarlijvig muizen bleken te zijn toegenomen lichaam en wit vetweefsel gewichten in vergelijking met muizen gevoed een N-dieet. RNA geëxtraheerd met behulp van fenol oplossing leverde monsters met goede zuiverheid. Leptine is een adipokine dat voornamelijk geproduceerd door vetweefsel en te correleren positief met vet massa16is bekend. Zoals verwacht, leptine mRNA uitdrukking toename in obesitas muizen samengaan met hun dikke massa.
Deze meth…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door Diabetes Canada.
Materials
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
