Respirometría de alta resolución para medir la función mitocondrial de las células intactas de Beta en presencia de compuestos naturales
Summary
El objetivo de este protocolo es medir el efecto de la glucosa mediada por cambios en la respiración mitocondrial en presencia de compuestos naturales en las células beta de la intacta 832/13 mediante respirometría de alta resolución.
Abstract
Respirometría de alta resolución permite la medición de consumo de oxígeno de las mitocondrias aisladas, células y tejidos. Las células beta juega un papel fundamental en el cuerpo por controlar niveles de glucosa en sangre a través de la secreción de insulina en respuesta a las concentraciones de glucosa elevada. La secreción de insulina es controlada por la respiración mitocondrial y el metabolismo de la glucosa. Por lo tanto, medir respiración intacta de la célula beta es esencial para poder mejorar la función de célula beta como tratamiento para la diabetes. Con intacto 832/13 INS-1 derivados de las células beta podemos medir el efecto de aumentar la concentración de glucosa en la respiración celular. Este protocolo nos permite medir la respiración de la célula beta en la presencia o ausencia de diferentes compuestos, que le permitirán determinar el efecto de dar compuestos sobre la respiración de la célula intacta. Aquí se demuestra el efecto de dos compuestos que ocurren naturalmente, antocianina monomérica y curcumina, sobre la respiración de la célula beta bajo la presencia de condiciones de alta glucosa (16,7 mM) o baja (2,5 mM). Esta técnica puede utilizarse para determinar el efecto de diversos compuestos sobre la respiración de la célula beta intacta en presencia de diferentes concentraciones de glucosa.
Introduction
El propósito principal de la célula beta pancreática es mantener sistema normoglycemia a través de la secreción de insulina estimulada por glucosa. Las células beta detecta cambios fisiológicos en la circulación de la glucosa en gran parte debido a la baja afinidad, transportador de glucosa de alta capacidad GLUT2 (glucosa transportador 2, Km 16,7 mM)1. Al aumentar los niveles de glucosa circulatoria, este transportador de baja afinidad alta capacidad facilita un aumento proporcional de la glucosa intracelular dentro de la célula beta. La glucosa se metaboliza a través de la glucólisis, el ciclo TCA (ciclo del ácido tricarboxílico) y respiración mitocondrial que resulta en elevados niveles celulares de ATP (trifosfato de adenosina). La concentración elevada de ATP bloquea los canales de ATP sensibles K+ , dando por resultado la despolarización de la membrana. Despolarización de la membrana provoca la apertura de canales de Ca2 + voltaje cerrada y posterior liberación de la vesícula obligado de gránulos de insulina2. Disfunción de célula beta es un sello de la Diabetes tipo 2 (T2D) y resulta en la secreción de insulina disminuida y mal controlada y en última instancia de la muerte de la célula beta3. Mecanismos que mantengan o mejoran la función de célula beta podrían ser utilizados como un tratamiento para T2D.
Los estudios han demostrado los efectos beneficiosos de origen natural compuestos a base de plantas en la célula beta pancreática4. Estos compuestos pueden tener su efecto a través de la creciente proliferación de la célula beta, la supervivencia o la secreción de insulina estimulada por glucosa. Por ejemplo, estudios recientes han demostrado que la antocianina monomérica aumenta la secreción de insulina estimulada por glucosa mediante el aumento de la respiración mitocondrial y aumento de ATP celular niveles5. Por lo tanto, entender cómo estos compuestos pueden aumentar la célula beta funcional masa es importante aprovechar estos compuestos como terapéutica potencial.
Respiración celular puede medirse a través de una serie de herramientas. Uso de un respirómetro alta resolución permite la titulación de moduladores químicos a una población celular permeabilized o intacto del6. Esta herramienta permite la adición de compuestos diversos, a diferentes concentraciones, dando así una amplia gama de información.
Dada la íntima conexión entre metabolismo de la glucosa y la función de células beta, las mediciones de la respiración celular son críticas. Las mediciones de la respiración celular se pueden hacer con que las células beta permeabilized o intactas, cada uno con su propio conjunto de ventajas y desventajas de7,8. Mientras que la permeabilización de las células beta permite medir diferentes aspectos de la cadena de transporte de electrones, lo hace sin respeto al mecanismo para inducir la respiración en la célula beta, la absorción de la glucosa y el metabolismo. Por lo tanto, el uso de la respiración de la célula beta unpermeabilized es una técnica muy útil para determinar la respuesta de las células beta a diversos niveles de la glucosa, utilizando el consumo de oxígeno como la lectura.
El propósito de esta técnica es medir consumo de oxígeno intactas INS-1 derivados de las células beta 832/13. Esta técnica nos permite determinar la respuesta de las células beta a las condiciones unstimulatory de la glucosa (glucosa 2,5 mM) así como de las condiciones estimulantes glucosa (16,7 mM de glucosa). Mientras que las células unpermeabilized no nos permiten probar individualmente complejo I, II o III del electrón transporte de cadena, la técnica de permitir mediciones con respiración de inhibición (Oligomycin A), desacoplada IV complejo (FCCP-carbonilo cianuro- 4– phenylhydrazone (de trifluoromethoxy)) y totalmente inhibida (Antimycin A) la respiración. Este estudio demuestra la eficacia de la medición de la respiración en intactas unpermeabilized las células beta pancreáticas, así como el efecto de dos compuestos que ocurren naturalmente, antocianina monomérica y curcumina, sobre la respiración de la célula beta.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de este protocolo es utilizar respirometria de alta resolución para medir tasas respiratorias en intacto las células beta pancreáticas. Este método permite la medición de la respuesta de la célula beta a niveles creciente de la glucosa. El protocolo también permite el tratamiento previo con varios compuestos, como se demuestra en el presente Protocolo con el natural monómero epicatequina o curcumina4,5. Tratami…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a miembros de los laboratorios Tessem y Hancock para asistente y discusión científica. Los autores agradecen a Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) para proporcionar la fracción de monómero epicatequina derivados cacao. Este estudio fue apoyado por una beca de la Fundación de educación y la investigación acción Diabetes al JST.
Materials
| O2k Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Instrument for high-resolution respirometry |
| DatLab 6 Program | Oroboros Instruments | 27141-01 | Computer program for analysing high-reolution respirometry |
| INS-1 832/13 cell line | Duke University Medical Center | NONE | Beta cell line, gift from Dr. Christopher Newgard |
| Curcumin | Sigma | C7727 | Pre-treatment of beta cells |
| Cocoa epicatechin monomer | Virginia Polytechnic Institute and State University | NONE | Pre-treatment of beta cells, gift from Dr. Andrew Neilson |
| Trypsin | Sigma | T4049 | For cell culture |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | 832/13 beta cell media |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | 832/13 beta cell media component |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4458 | 832/13 beta cell media component |
| HEPES | Sigma | H3662 | 832/13 beta cell media component/ 1x SAB Buffer |
| Glutamine | Caisson | GLL01 | 832/13 beta cell media component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | 832/13 beta cell media component |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | 832/13 beta cell media component |
| NaCl | Fisher | S271 | Component of 10x SAB buffer |
| KCl | Sigma | P9541 | Component of 10x SAB buffer |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Component of 10x SAB buffer |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | Component of 10x SAB buffer |
| D-(+)-Glucose Solution | Sigma | G8769 | Component of 1x SAB buffer, chemical for respiration assay |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of 1x SAB buffer |
| 35% BSA Solution | Sigma | A7979 | Component of 1x SAB buffer |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Component of 1x SAB buffer |
| 200 proof ethanol | Sigma | 459844 | Washing Oxygraph O2k Chambers |
| Oligomycin A | Sigma | O4876 | Chemicals for respiration assay |
| FCCP | Sigma | C2920 | Chemicals for respiration assay |
| Anitmycin A | Sigma | A8674 | Chemicals for respiration assay |
| BCA Protein Kit | Thermo Fisher | 23225 | For determining protein concentration |
References
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