Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) de Modificações de Histonas de Saccharomyces cerevisiae
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo para a imunoprecipitação da cromatina de histonas modificadas de brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA é usado posteriormente para PCR quantitativo para interrogar a abundância e a localização de modificações borne-translational do histone durante todo o genoma.
Abstract
Modificações do histone pós-traducional (PTMs), tais como a acetilação, metilação e fosforilação, dinamicamente são reguladas por uma série de enzimas que adicionar ou remover estas marcas em resposta a sinais recebidos pela célula. Estes PTMS são principais contribuintes para a regulamentação dos processos, tais como controle de expressão de gene e reparo do DNA. Imunoprecipitação da cromatina (chIP) tem sido uma abordagem instrumental para dissecar a abundância e a localização de muitos PTMs de histona por todo o genoma em resposta a diversas perturbações para a célula. Aqui, um método versátil para a realização de microplaqueta das histonas post-translationally modificadas de brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é descrito. Este método baseia-se na reticulação de proteínas e DNA usando formol tratamento de culturas de leveduras, geração de levedura lisados por grânulo batendo, solubilização de fragmentos de cromatina por nuclease micrococcal e imunoprecipitação de histona-DNA complexos. DNA associado com a marca do histone de interesse é purificado e submetido a análise PCR quantitativo para avaliar seu enriquecimento em múltiplos loci durante todo o genoma. Experiências representativas sondando a localização das marcas de histona H3K4me2 e H4K16ac em sua e levedura mutante são discutidas para demonstrar a interpretação e análise de dados. Este método é adequado para uma variedade de histona PTMs e pode ser realizado com diferentes cepas mutantes ou na presença de diversos estresses ambientais, tornando-se uma excelente ferramenta para investigar as alterações na dinâmica da cromatina em condições diferentes.
Introduction
A modificação pós-traducional dinâmica (PTM) de histonas é um mecanismo regulatório essencial para muitos processos de DNA-modelo, incluindo a transcrição, replicação e reparo de DNA1,2. A capacidade de determinar a abundância e a localização exacta das histonas modificadas concomitantes com esses processos, portanto, é fundamental para compreender seu regulamento sob condições diferentes na célula. O desenvolvimento da imunoprecipitação da cromatina (chIP) como um método largamente resultado de estudos bioquímicos das interações de proteínas com DNA, particularmente em vitro métodos usando química crosslinkers, juntamente com a necessidade de avaliar o natureza dinâmica do proteína-ADN interações em vivo e em regiões específicas do genoma,4,3,5. O avanço das tecnologias de sequenciamento e PCR quantitativo (qPCR) também ampliou a capacidade de realizar experimentos de microplaqueta com comparações quantitativas e através de genomas toda, tornando-se uma poderosa ferramenta para dissecar interações DNA-proteína no vários níveis.
Atualmente, o chIP é um método necessário para qualquer grupo de pesquisa interessado em regulamento mediada por cromatina do genoma como existem sem métodos comparáveis para interrogar diretamente a ligação física entre uma histona modificada e um locus específico de genômico em vivo. Apesar de variações deste método usando a próxima geração de sequenciamento para mapear modificações do histone em todo o genoma de6,7 estão disponíveis, essas abordagens podem abordar diferentes questões científicas e sua escala, o custo e recursos técnicos podem ser um fator limitante para alguns grupos de pesquisa. Além disso, a microplaqueta-qPCR alvo é necessário complementar estas abordagens, fornecendo métodos para ambos otimizar o protocolo chIP antes de sequenciamento e validar resultados de conjuntos de dados epigenomic. Espectrometria de massa com base em abordagens para identificar o conjunto completo de histona marcas associadas com regiões genômicas tem também emergiu8,9,10,11, no entanto, estas abordagens têm algumas limitações sobre quais regiões do genoma podem ser sondadas e exigem perícia técnica e instrumentação que não estará disponível para todos os grupos de pesquisa. Portanto, o chIP permanece um método fundamental para analisar a abundância e distribuição de modificações do histone sob diversas condições para todos os grupos de pesquisa interessados em epigenética, da cromatina e a regulação de funções genômicas.
Aqui, descrevemos um método para o modelo de chIP usando o fermento budding Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) para investigar a distribuição de PTMs de histonas na cromatina. Esta abordagem se baseia em um número de componentes principais da microplaqueta protocolos desenvolvidos no fermento e também aplicado ao modelo diversos sistemas12,13. Interações entre modificados histonas e DNA na célula são preservadas por reticulação com formaldeído. Após preparação lisada, fragmentos de cromatina são solubilizados em fragmentos de tamanho uniformemente por digestão com nuclease micrococcal. Imunoprecipitação das histonas modificadas é realizada com anticorpos comerciais ou gerados pelo laboratório e qualquer associado DNA é isolado e analisado para enriquecimento em determinadas regiões genômicas usando qPCR (Figura 1). Para muitas modificações do histone, a quantidade de DNA obtido a partir deste protocolo é suficiente para o ensaio de mais de 25 diferentes loci genômicos por qPCR.
Este método de microplaqueta é altamente versátil para monitorar a distribuição de uma modificação do histone único em vários cepas mutantes ou condições ambientais, ou para testar várias modificações do histone em sua células em um número de loci genômicos. Além disso, vários componentes do protocolo são facilmente ajustáveis para otimizar a deteção de qualquer marcas altamente ou humilde-abundante de histona. Finalmente, realizando a microplaqueta das histonas modificadas em leveduras brotamento fornece a oportunidade de usar controles chaves para a especificidade do anticorpo que não estão amplamente disponíveis em outros sistemas. Ou seja, cepas de leveduras podem ser geradas que carregam mutações pontuais em resíduos de histona que são direcionados para a modificação, e, em alguns casos, há apenas uma única enzima que cataliza modificação em um resíduo de histona particular (ex. lisina de histona metiltransferases). Portanto, microplaqueta pode ser executada em qualquer as histona mutante ou enzima exclusão cepas a ensaiar a medida em que a ligação não-específica do anticorpo pode ser ocorrendo e gerando resultados falso-positivos. Este controle é particularmente valioso para anticorpos recém-desenvolvidos e pode mesmo ser usado para validar a especificidade do anticorpo para modificações do histone conservado antes da sua utilização em outros sistemas. Essa abordagem complementa outros métodos para testar a especificidade do anticorpo que distinguem entre Estados-Membros diferentes de modificação (tais como mono-, di – e tri-metilação), incluindo matrizes de peptídeos modificados de sondagem e realizando borrões ocidentais das histonas ou nucleossomas com modificações definidas. Globalmente, o chIP em leveduras brotamento é um poderoso método para avaliar a dinâmica da histona PTMs durante todo o genoma e dissecando os mecanismos que regem a sua regulação.
Protocol
Representative Results
Discussion
O procedimento descrito aqui permite a recuperação eficiente de DNA associado a histonas modificadas em células de levedura por imunoprecipitação. Isto é seguido por qPCR usando as primeiras demão que amplificam regiões de interesse para determinar o local enriquecimento ou esgotamento das modificações do histone específico. Apesar de ser desenvolvido como um método há quase 20 anos, microplaqueta permanece o ensaio decisivo para investigar o estatuto de modificação de histona a diferentes regiões genômi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer aos membros do laboratório verde para debates úteis. Este trabalho foi financiado em parte por subvenções de NIH R03AG052018 e R01GM124342 para E.M.G.
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
References
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