التصوير خيوط متوسطة وميكروتوبوليس مع الفحص المجهري 2-الأبعاد التعمير البصرية العشوائية المباشرة
Summary
والهدف العام لهذه المنهجية إعطاء أفضل الظروف التجريبية من إعداد نموذج للحصول على الصور، وإعادة الإعمار من أجل أداء 2D ثنائي اللون دستورم الصور ميكروتوبوليس وخيوط متوسطة في الخلايا الثابتة
Abstract
سيتوسكيليتون، تتألف من أكتين ميكروفيلامينتس، ميكروتوبوليس، وخيوط متوسطة (إذا كان)، دوراً رئيسيا في السيطرة على شكل الخلية والأقطاب وحركية. درس تنظيم شبكات أكتين وميكروتوبولي على نطاق واسع ولكن أن الاتحاد لا بعد تماما وتتميز. الاتحاد يكون متوسط قطرها 10 نانومتر وشكل شبكة تمتد في جميع أنحاء السيتوبلازم الخلية. أنها ترتبط فعلياً مع الأكتين وميكروتوبوليس من خلال المحركات الجزيئية و cytoskeletal linkers. هذه الرابطة ضيق يقع في صميم الآليات التنظيمية التي تكفل تنظيم الشبكات cytoskeletal الثلاث المطلوبة لمعظم وظائف الخلية المنسقة. ولذلك من الأهمية بمكان لتصور الاتحاد وحدها وأيضا جنبا إلى جنب مع كل من الشبكات الأخرى سيتوسكيليتال. إذا كانت شبكات غير كثيفة جداً في معظم أنواع الخلايا، لا سيما في الخلايا الدبقية، مما يجعل من الصعب جداً تحقيق مع الفحص المجهري fluorescence القياسية قرارها (الأفقي القرار ~ 250 nm). مباشرة “العشوائية بصري التعمير مجهرية” (دستورم) أسلوب يسمح مكسب في القرار الأفقي من حجم واحد. هنا، نحن تبين أن القرار دستورم الجانبي كافية لحل المنظمة كثافة الشبكات إذا، وعلى وجه الخصوص، إذا كانت حزم المحيطة microtubules. هذه الرابطة ضيق من المحتمل أن تشارك في تنظيم منسق لهذه الشبكات اثنين وأيار/مايو، وشرح كيف فيمنتين الاتحاد القالب واستقرار المنظمة microtubule فضلا عن يمكن أن تؤثر على الاتجار حويصلية التابعة ميكروتوبولي. وبصورة أعم، نعرض كيفية مراقبة عنصرين cytoskeletal مع تقنية دستورم المزدوج-لون يجلب ثاقبة جديدة من التفاعل المتبادل بينهما.
Introduction
هيولى خيوط متوسطة (IFs) هي هومو 10 نانومتر-قطر-أو هيتيروبوليميرس من نوع الخلية مجموعة فرعية معينة من البروتينات إذا. ويشارك الاتحاد في مجموعة كبيرة من الوظائف الخلوية مثل الخلية استجابات حركية وانتشارها والإجهاد. دورهم الرئيسي هو أبرز حقيقة أن أكثر من 90 من الأمراض البشرية هي الناجم مباشرة عن طفرات في البروتينات إذا؛ على سبيل المثال، التغييرات في تكوين إذا ترافق نمو الورم وينتشر1،،من23. تتزايد الأدلة التي تعمل بثلاثة أنظمة سيتوسكيليتون في التعاون لمراقبة الوظائف الخلوية مثل الخلية الاستقطاب، شعبة والهجرة2،3. إذ هناك اقتران ضيق بين الهيكل المكاني، والوظائف، من الأهمية بمكان للحصول على رؤى في الهيكل التنظيمي المتكامل مع خيوط أخرى وفهم أفضل سيتوسكيليتال للتحدث عبر. تنص هذه المادة على بروتوكول لأداء ثنائي اللون دستورم (المباشر العشوائية بصري التعمير مجهرية) تقنية فائقة القرار4 وكيف يتم استخدامه للتحقيق بالتفاعل بين إذا و microtubules في ثابت، ومثقف. الخلايا في 2 الأبعاد (2D).
وقد وضعت العديد من التقنيات فائقة القرار على مدى العقد، وهناك اكتشافات كانت في الأصل على جائزة نوبل في الكيمياء في عام 20145. تقع بين جميع هذه التقنيات الأساليب المستندة إلى التعريب جزيء واحد مثل النخيل6 (فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية) الذي يستخدم البروتينات الفلورية فوتوسويتشابل، العاصفة7 مع أزواج من فلوروفوريس أو دستورم4 مع فلوروفوريس التقليدية. جميع هذه الأساليب تقوم على نفس المبدأ الذي يتألف من (ط) تبديل معظم الصحفيين الفلورية إلى حالة “إيقاف التشغيل” “(غير-فلوري)، (ثانيا) تفعيل العشوائية لمجموعة فرعية منها في فلوري الدولة من أجل ترجمة هذه الموقف المكاني بدقة نانومتر، و (iii) تكرار هذه العملية من أجل تفعيل العديد من مجموعات فرعية من فلوروفوريس قدر الإمكان. يتم إعادة إنشاء صورة نهائية باستخدام جميع تعريب من جزيئات المنشط، تقديم قرار جانبية وصولاً إلى ~ 20-40 نانومتر. عدة نظم الضوئية تجارياً يسمح بألم/العاصفة متاحة الآن لعلماء الأحياء لإجراء التجارب الروتينية. هنا، كان يستخدم واحد مثل هذا النظام لدراسة هيكلية رابطة microtubules والاتحاد. بين كل جزيء مفرد المستندة إلى تعريب الأساليب، اختير هذا الأسلوب المزدوج-لون دستورم، لأنها مناسبة تماما لمراقبة المناطق رقائقي رقيقة جداً (< 1 ميكرومتر) من الخلايا ملتصقة ويمكن أن توفر تحسنا كبيرا من دقة الصورة مع الحد الأدنى من استثمار الوقت والمال. وفي الواقع، دستورم هو تقنية مريحة للغاية وتنوعاً متوافق مع الأصباغ العضوية القياسية المستخدمة بشكل روتيني لتلطيخ الخلوية والفلوره.
بينما الصور دستورم لون واحد بسيطة نسبيا للحصول على استخدام فلوروفوري Alexa6478، يتطلب دستورم اللون المزدوج تحسين ظروف تجريبية بحيث يمكن وميض الأصباغ اثنين بشكل صحيح في المخزن المؤقت الذي تم اختياره، ولا سيما عندما يكون هناك محدودة طاقة الليزر. أوراق ممتازة متاحة بالفعل على أساليب لإعداد التصوير متعدد الألوان مع دستورم9،،من1011،،من1213، وهذه الورقات شرح بالتفصيل المصادر الممكنة من القطع الأثرية ودقة وضوح الصورة المتدهورة وكيفية التغلب عليها. في هذه المقالة، والظروف التجريبية الأمثل من حيث تثبيت الخلايا، إيمونوستينينج، وإعداد نموذج، اقتناء التصوير وإعادة بناء صورة موصوفة بغية الحصول على الصور من شبكات إذا هيولى كثيفة وميكروتوبوليس في الخلايا الدبقية مع دستورم اللون المزدوج. بإيجاز، الطريقة استخراج/التثبيت الموضحة في كازو et al12 تم تكييفها للخلايا الدبقية واستخدامها مع خطوة بعد انتهاء تثبيت، تركيز الأجسام المضادة الأمثل، مخزن مؤقت عاصفة مع 10 ملم وصف اتفاق بيئي متعدد الأطراف في ديمبسي9 et al. الذي كان وجد أن الأمثل لإعداد تجريبية ونوع العينة.
الخلايا الدبقية express أساسا ثلاثة أنواع من البروتينات إذا: فيمنتين، نيستين وتوصيني (الدبقية الحمضية البروتين فيبريلاري). وعرضت هذه البروتينات الثلاثة بلمرة يشترك في أستروسيتيس14. أظهرنا سابقا باستخدام فائقة القرار تنظيماً إضاءة مجهرية (SIM ريال) أن ويمكن الاطلاع على هذه البروتينات إذا كان ثلاثة في الشعيرة إذا واحد نفسه وأنها عرض التوزيع وديناميات مماثلة في الخلايا الدبقية 15. نظراً للتشابه بين البروتينات إذا ثلاثة، تلطيخ فيمنتين كمراسل لشبكة الاتصال إذا كان كله. باستخدام دستورم، تمكنا من حل كيف إذا شكل حزم على طول ميكروتوبوليس، التي لم يكن من الممكن مع حيود محدودة المجهري تقنيات15. قد تساعد هذه الملاحظات فهم كيف يمكن للاتحاد فيمنتين microtubules القالب وتنظم على مسار النمو، تعزيز الحفاظ على محور قطبية أثناء الهجرة الخلية16. صور فائقة الدقة قدمت معلومات أساسية عن التفاعل المتبادل بين نظامين فرعيين cytoskeletal، والتبصر في الربط بين الرابطة المكانية والوظيفة المحلية التي يمكن أن تكون من نوع خلية محددة17. وبصفة عامة، يمكن استخدام دستورم اللون المزدوج للدراسة الحديث المتبادل بين العناصر سيتوسكيليتال أو أنواع أخرى من العضيات، شريطة أن يتم التوصل إلى شروط إيمونوستينينج جيدة من حيث الكثافة وخصوصية. سوف تكون هذه التقنية مفيدة لأفضل وصف التغييرات cytoskeleton لاحظ أثناء أستروجليوسيس وفي جليوبلاستوما، والورم الأكثر شيوعاً والأكثر الخبيثة للنظام العصبي المركزي، حيث يتم التعبير عن البروتينات إذا غيرت 18 ،19،،من2021.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة في البروتوكول
نحن الحاضرين هنا بروتوكول الذي يقلل من القطع الأثرية في صور دستورم ميكروتوبوليس والاتحاد في الخلايا الدبقية. يمكن إنشاء القطع الأثرية في كل خطوة من إعداد العينة والتصوير: التثبيت، حجب، إيمونولابيلينج، الانجراف خلال اقتناء، غير أمثل الظ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر ليليك ميكائيل، فاكلاريس أوريستيس ونيكولا بورغ لمناقشة مثمرة، أندري اريستوف وايلينا رينسين للحصول على مساعدة تقنية فائقة القرار وسيتارامان شيلاجا للقراءة المتأنية للمخطوطة. ونعترف مع الامتنان ستيش أوتيتشس بيويماجينج الضوئية (إيماجوبولي) من معهد باستور (باريس، فرنسا)، فضلا عن شبكة البنية التحتية بيويماجينج فرنسا تدعمها وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية (ANR-10-إينسب-04؛ الاستثمارات في المستقبل)، والقارسة ضمور (برنامج Domaine د ‘ الاهتمام القاهرة-مالينف) لاستخدام المجهر اليرا. أيد هذا العمل مكافحة السرطان الرابطة والوكالة الفرنسية للبحوث الوطنية (ANR-16-CE13-0019).
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 41090-028 | cell culture |
| non essential amino acid | Gibco | 1140-050 | cell culture 1/100e |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | cell culture 1/100e |
| Fœtal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | cell culture 1/10e |
| 0,05 % Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | cell culture |
| PBS 10x | fischer scientific | 11540486 | cell culture |
| coverslip 18 mm n°1,5H | Marienfield/Dominic dutsher | 900556 | coverslips |
| paraformaldehyde (PFA) solution | Sigma | F8775 | cell fixation |
| glutaraldehyde | Sigma | G5882 | cell fixation |
| triton X100 | Sigma | T9284 | non ionic surfactant. Used for cell fixation |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 452904-25ML | cell fixation |
| BSA | Sigma | A7906 | sample passivation 3% in PBS |
| Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse | Sigma | V6630 | primary antibodies |
| Rat anti alpha tubulin | Biorad | MCA77G | primary antibodies |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Fisher scientific | 10635923 | secondary antibodies |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Fisher scientific | 10226162 | secondary antibodies |
| TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Fisher scientific | T7279 | fluorescent beads |
| Chamlide magnetic chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL |
| Cysteamine (MEA) | Sigma | 30070 | for the blinking buffer |
| glucose oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G0543 | for the blinking buffer |
| glucose | sigma | for the blinking buffer | |
| catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | for the blinking buffer |
| Tris (trizma) | Sigma | T1503 | for the blinking buffer |
| Wash-N-Dry coverslip rack | Sigma | Z688568 | |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | paraffin film |
| ultrasonic cleaner | Fisher scientific | 15-335-6 | |
| plasma cleaner | Harrick plasma | PDC-32G-2 |
References
- Herrmann, H., Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).
- Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up. Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).
- Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects. Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Gevaux, D. Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale. Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy. J Vis Exp. (79), (2013).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Dempsey, G. T. A user’s guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging. Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy. Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).
- Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. Simple buffers for 3D STORM microscopy. Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).
- Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
- Leduc, C., Etienne-Manneville, S. Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization. J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).
- Gan, Z., et al. Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration. Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).
- Nieuwenhuizen, R. P., et al. Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy. PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).
- Yang, Z., Wang, K. K. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).
- Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression. J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).
- Hol, E. M., Pekny, M. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system. Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).
- Skalli, O., et al. Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins. Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).
- Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).
- Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924 (2015).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers. PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nat Commun. 6, 7933 (2015).
- Nieuwenhuizen, R. P., et al. Measuring image resolution in optical nanoscopy. Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
