Abordagem em duas fases para explorar e tarde-estágios iniciais de formação do órgão no modelo aviária: O Timo e glândulas paratireoides organogênese paradigma
Summary
Este artigo fornece uma abordagem atualizada para o sistema de Quimera de codorna-galinha clássica para estudar a formação do órgão, combinando procedimentos experimentais in vitro e in ovo romance.
Abstract
O embrião aviária, como modelo experimental, tem sido de extrema importância para descobertas seminais em biologia do desenvolvimento. Entre várias abordagens, a formação de codorna-frango quimeras e a utilização da membrana corioalantoicas (CAM) para sustentar o desenvolvimento de tecidos ectópicos datam do século passado. Hoje em dia, a combinação dessas técnicas clássicas com recentes em vitro metodologias oferece novas perspectivas para explorar ainda mais a formação de órgãos.
Aqui nós descrevemos uma abordagem em duas fases para estudar cedo e tarde-estágios da organogênese. Brevemente, região embrionária que contém o território presuntivo do órgão é isolada da codorna embriões e crescido em vitro em um sistema de organotypic (até 48 h). Tecidos cultivados são posteriormente enxertados o CAM de um embrião de galinha. Após 10 dias de desenvolvimento no ovo , completamente formada de órgãos são obtidos de tecidos transplantados. Este método também permite que a modulação de vias de sinalização pela regular Administração de agentes farmacológicos e manipulação genética de tecido ao longo de etapas no desenvolvimento in vitro e no ovo . Além disso, o desenvolvimento de tecidos pode ser coletado em qualquer janela de tempo para analisar o seu perfil de expressão gênica (usando microarrays, PCR quantitativo (qPCR), etc.) e morfologia (avaliados com imunoquímica e histologia convencional).
O procedimento experimental descrito pode ser usado como uma ferramenta para acompanhar a formação de órgãos fora do embrião aviária, desde as fases iniciais da organogênese totalmente formado e órgãos funcionais.
Introduction
Embriões aviários têm sido amplamente utilizados em estudos de biologia do desenvolvimento seminal. As principais vantagens do modelo aviária incluem a possibilidade de abrir o ovo, o acesso relativamente fácil para o embrião e a capacidade de executar micromanipulação. Alguns exemplos incluem o sistema clássico de codorna-galinha de Quimera para estudar a célula destino1, aplicação específicas de fatores de crescimento para o embrião2e o crescimento das estruturas celulares ectópica no CAM1,3, 4.
Para obter novos insights sobre estágios distintos de formação do órgão, recentemente desenvolvemos um método que combina técnicas de enxertia com manipulação em vitro de tecidos embrionários5. A abordagem em duas fases permite a discriminação e a exploração de ambos – e tarde-fases iniciais da organogênese, que muitas vezes são limitados devido ao tecido altamente dinâmico e complexas interações2. Além disso, a falta de marcadores de tecido-específica adequados frequentemente limita o uso de geneticamente modificados animal modelos6. Este novo método da abordagem em duas fases supera largamente tais limitações.
Para estudar estágios iniciais de formação do órgão, na primeira etapa, o território de codorna embrionárias compreendendo o rudimento do órgão em perspectiva é isolado e crescido em um sistema de organotypic em vitro por 48 h. Durante este período, modulação farmacológica das vias de sinalização específicas pode ser executada com a adição de drogas para o meio de cultura5,7. Além disso, tecidos cultivados podem ser coletados em qualquer fase de crescimento em vitro e vasculhados a procura de expressão gênica (usando métodos como qPCR, microarrays, etc.).
Na segunda etapa, 48 h-cultivadas tecidos são então enxertados o CAM de um embrião de galinha (c) no dia embrionário (E) 8 (cE8) (Hamburger e Hamilton (HH)-estágios 33-35)8. O CAM comporta-se como um fornecedor vascular de nutrientes e permite que o gás troca1,3,4 aos tecidos enxertados, permitindo seu desenvolvimento no ovo por longos períodos de tempo. Nesta etapa experimental é especialmente adequada para estudar os estágios finais da organogênese, como órgãos completamente formados podem ser obtidos após 10 dias no ovo desenvolvimento5,9,10,11 . Análise morfológica é facilmente realizada por histologia convencional para confirmar a formação adequada do órgão e a origem do doador das células pode ser identificada por imuno-histoquímica utilizando anticorpos espécie-específicos (ou seja, MAb codorna PeriNuclear (QCPN)). Durante o período de incubação de CAM, enxertos também podem ser cultivados na presença de agentes farmacológicos e coletados em qualquer fase de desenvolvimento para avaliar a progressão da organogênese.
A abordagem em duas fases, aqui descrita em profundidade, já foi empregada em Figueiredo et al . 5 a explorar o desenvolvimento de Primórdio comuns aviária paratireoide/Timo. Por conseguinte, as particularidades inerentes dos territórios embrionárias e estágios de desenvolvimento envolvido na organogênese do Timo e glândulas paratireoides serão apresentados abaixo.
O Timo e glândulas paratireoides epitélios, embora funcionalmente distintos, derivam da endoderme das bolsas faríngeas (PP)12. Em aves, os epitélios destes órgãos originam o terceiro e quarto PP endoderme (3/4PP)12, enquanto nos mamíferos o epitélio tímico deriva o 3PP e o epitélio das glândulas paratireoides deriva do 3PP e 3/4PP no mouse e humano, respectivamente13,14.
Uma das primeiras etapas na formação destes órgãos é o surgimento de Timo discreto e paratireoides domínios no Primórdio comuns. Frango, estes domínios podem ser identificados por hibridação in situ , com marcadores moleculares específicos, e 4.515. Como o desenvolvimento prossegue, estes rudimentos de órgãos individualizar e separam-se da parede posterior da faringe, enquanto uma fina cápsula mesenquimal, formada por células da crista neural-derivado, os rodeia (em E5; HH-stage-27). Mais adiante, o epitélio tímico é colonizado por células progenitoras hematopoiéticas (no E6.5; HH-stage 30)12.
Como em estudos clássicos de codorna-frango1,12, a abordagem em duas fases é particularmente útil para estudar a formação de órgãos hematopoiéticos/linfoides, ou seja, o Timo5. Como a codorna explantes, com o rudimento do órgão, é enxertado no embrião frango antes da colonização de células progenitoras hematopoiéticas, um timo quimérico é formado com galinha pelo sangue progenitoras infiltrando uma contrapartida de epitélio tímico codorna. Este método é, portanto, uma ferramenta útil para explorar a contribuição das células hematopoiéticas no desenvolvimento do sistema hemato/linfoide aviária.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um aspecto crucial para o sucesso deste método é a qualidade da galinha e codorna ovos. Considerando os períodos de incubação longos, particularmente durante o ensaio em ovo , uma boa qualidade de ovos de galinha melhora viabilidade taxas (até 90%) até ao final do procedimento. Para conseguir isso, testar os ovos de diferentes fornecedores. Incubar ovos de unmanipulated por longos períodos (até 16-17 dias) e verificar o seu desenvolvimento. Para ser considerado um lote de boa qualidade, mais de 80% dos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos ao António Cidadão, Isabel Alcobia e Leonor Parreira para a leitura crítica do manuscrito, a Padma Akkapeddi para a narração, e Vitor Proa do serviço de histologia do Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para suporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro e Hugo Silva da Unidade de audiovisuais (unidade do Audiovisual), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa para seu compromisso excepcional para a produção deste vídeo. Reconhecemos a Leica Microsystems para gentilmente fornecendo um estereoscópio equipado com sistema de vídeo e a Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, S.A. por contribuir com codorna fertilizado ovos. Este trabalho foi apoiado pela Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
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