Метод Optogenetic для контроля и анализа картин выражения гена в ячейке для взаимодействия
Summary
Здесь мы представляем протокол для анализа к ячейке передачи колебательного информации по optogenetic управления и жить мониторинга экспрессии генов. Этот подход обеспечивает уникальную платформу для тестирования функциональное значение динамического ген выражение программ в многоклеточных систем.
Abstract
Клетки должны должным образом реагировать на височно меняющихся средах, которые находятся под влиянием различных факторов от окружающих клеток. Паз, сигнальный путь является одной из таких важнейших молекулярных механизмов для коммуникаций в ячейке, которая играет ключевую роль в нормальное развитие зародышей. Этот путь включает в себя к ячейке передачи колебательного информации с Ультрадианных ритмов, но несмотря на прогресс в методы молекулярной биологии, она была сложной для выяснения влияния многоклеточных взаимодействия колебательных гена динамика. Здесь мы представляем протокол, который позволяет optogenetic контроль и живой мониторинг картин выражения гена в височной точно. Этот метод успешно показал, что межклеточной и внутриклеточной периодические входы сигнализации Notch увлекают внутренние колебания перестройкой частоты и фазы, переход на одну ячейку резолюции. Этот подход применим к анализ динамических особенностей различных сигнальных путей, предоставляя уникальную платформу для тестирования функциональное значение динамического ген выражение программ в многоклеточных систем.
Introduction
К ячейке коммуникации играют решающую роль в эмбриональных патронирования в процессы развития. В позвоночных эмбрионы выпол структуры, называемые сегменты формируются вдоль оси передней задней тела с прецизионной точностью височной под контролем времени поддержанию часы, под названием сегментации будильник1. В ходе этого процесса группы клеток presomitic мезодермы (PSM) периодически преобразуются в сегменты в синхронном режиме. Этот процесс включает экспрессии генов синхронизированные колебательных и PSM клетки, которые колеблются в фазе образуют же сегменты. Период экспрессии генов колебательной составляет около 2-3 ч в мышах и около 30 мин в данио рерио. При отрыве, PSM клетки теряют синхронности2,3, но когда они вычисляются повторно, они могут самостоятельно организовать и восстановить населения синхронности4, о том, что муфта ячеек ключ для синхронизированных колебания.
Активные усилия показали, что сигнальных молекул в Дельта-Notch пути тесно связаны с синхронизированной колебания сегментации будильник генов. Фармакологических ингибиторы или генетические мутации Notch сигнализации десинхронизироваться населения осцилляторы. В данио рерио мутанты Notch сигнализации компоненты, такие как DeltaC, DeltaD и Notch1a, отображения асинхронных колебаний5,6. В мыши или куриных эмбрионов не только лиганд Notch Дельта like1 (Dll1), но и Notch модулятор Lunatic fringe (Lfng) является обязательным для синхронизированных колебания7,8,9. Однако, было трудно для тестирования функциональных возможностей таких молекул для передачи динамической информации от ячейки к ячейке, потому что временных резолюций обычных возмущений гена регулирование динамики не были достаточными для расследования процессы сроки 2-3 ч (Ультрадианных ритмов).
Мы недавно разработали комплексный метод для контроля и мониторинга картин выражения гена в mammalian клетках10. Эта технология позволяет индукции импульсов выражение гена путем периодического света освещение Ультрадианных временных масштабах. Этот протокол представляет методы для создания светочувствительных клеток линии и наблюдать динамических ответов репортер клеток, клеток люминесценции мониторинга в контексте сообщений к ячейке. Этот метод применим для анализа многих других сигнальных путей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы показали метод для контроля динамики выражения гена с периодичностью 2-3 ч. Эта шкала времени намного короче, чем в других обычных систем, включая системы тет-на и оригинальная система Лайтон. Основные параметры для достижения Ультрадианных время весы являются полураспада фото индуц?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана JST, PRESTO (А.И.), основных исследований для эволюционной науки и техники (JPMJCR12W2 (р.к.)), субсидий для научных исследований в инновационных областях (Министерство образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ), Япония 26119708 (А.И.) и 16 H 06480 (р.к.)), научные исследования () (Япония общества для поощрения науки (JSP) 24240049 (р.к.)) и молодых ученых (A) (JSP-страницы 15 H 05326 (А.И.)) и субсидий для научных исследований в инновационных областях «флуоресцирования Live imaging» МПКСНТ, Японии и платформы для динамического подходов для жизни системы от МПКСНТ, Япония.
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
