طريقة لزرع جزيرة ليلى إلى الثرب في الماوس
Summary
يتم عرض طريقة لزرع أومينتال من الجزر الصغيرة في ماوس. الجزر الصغيرة المعزولة مختلطة مع المائية ويوضع الخليط داخل الحقيبة أومينتال بالماوس السكري. ثم يتم رصد الجلوكوز في الدم، وإجراء التحليل المناعية histochemical.
Abstract
واقترح زرع جزيرة ليلى يكون علاج محتمل لمرض السكري من النوع 1. الأخيرة أدلة مقنعة تشير إلى أن ضخ جزيرة منتثر داخل الأوعية بعيدة عن المثالية وبالتالي، عادت إلى الظهور كموقع يحتمل أن تكون قيماً لزرع جزيرة ليلى الثرب. وتتطلب هذه التجربة عزلة الجزر الصغيرة ذات جودة عالية وغرس الجزر إلى المستلمين السكري. زرع الأعضاء الثرب يتطلب الخطوات الجراحية التي يمكن تحسين أداءهم بصريا. هنا، يتم عرض خطوات تفصيلية لهذا الإجراء. ويرد هنا طريقتين لخلط الجزر المنعزلة مع hydrogel قبل وضع الخليط في الحقيبة أومينتال من الفئران السكري. الهلاميات المائية المختلفة المستخدمة لمختلف الظروف. وتم رصد مستويات السكر في الدم من المستلمين الماوس السكري من الجزر سينجينيك في الثرب مدة تصل إلى 35 يوما. تم التضحية ببعض الحيوانات بعد 14 يوما لإجراء تحليل histochemical المناعية. يمكن استخدام هذا النهج زرع قبل الإكلينيكية كالبيانات الأولية المؤدية إلى الترجمة إلى زرع السريرية.
Introduction
حسب الدولية السكري الاتحاد (جيش الدفاع الإسرائيلي)، مرض البول السكري يؤثر حاليا 382 مليون شخص، مع زيادة المتوقعة إلى 592 مليون شخص قبل 20351. في زرع جزيرة متمكنة وإكسينوجينيك على حد سواء، ضروري العلاج كآبته الجهازية. دون الكبت المناعي، الرفض المناعي سببا رئيسيا ل فقدان الفساد2. وهناك أيضا مشكلة كبيرة من جزيرة زرع خسارة بسبب أن الدم الفورية بوساطة تفاعل (إيبمير)3،4. ومع ذلك، حتى في حالة عدم استجابة مناعية مثل سينجينيك أو نماذج السيارات-زرع الأعضاء، والخلايا جزيرة ليلى التي زرعها في الكبد عن طريق الوريد البابي يتم فقدها بسبب التهاب و/أو للظروف البيئية غير المواتية، مثل ضعف الدم توريد مع انخفاض الأوكسجين و/أو المواد الغذائية5،6. كنتيجة لذلك، بغية ضمان وظيفة التمثيل الغذائي الطويل الأجل، أعلى جزيرة الأرقام اللازمة للتعويض عن فقدان الخلية الأولى التي تقلل من انجرافتمينت7.
في محاولة لتحسين انجرافتمينت جزيرة ليلى، العديد من المواقع التشريحية بديلة تم التحقيق تجريبيا، فضلا عن سريرياً، مع واعدة، ولكن لا نهائي يؤدي إلى8. بينما بعض المواقع البديلة التي توفر الوصول السهل والأمن (على سبيل المثال.، والجلد، كبسولة الكلي والمعدة سوبموكوسا والغرفة الأمامية للعين) أو على سطح أوسع لأكبر جزيرة الجماهير (مثلاً.، التجويف الصفاقى)، البقاء على قيد الحياة والفسيولوجية أداء الأيضية الجزر زرع لا تزال محدودة، ويظل قلق9. ويجري البحث عن موقع مناسب أكثر لجزيرة انجرافتمينت.
الثرب كان من بين العديد من المواقع التشريحية التي تم التحقيق في التطور المبكر لزرع جزيرة ليلى، وأثبت بيئة ناجحة للجزر الصغيرة10،11،،من1213، 14. ومع ذلك، ضخ جزيرة إينترابورتال أصبح الواجب خيار السريرية في جزء منه إلى البساطة النسبية للإجراء ونماذج النجاح المبكر في الحيوان6. أيضا، في جزء منه، السلبيات المرتبطة بهذا الموقع، خسائر فادحة لا سيما في جزيرة ليلى مبكرا، كانت أقل تقييد مفهومة وأقل في الأيام الأولى لزرع جزيرة التجريبية كالحقل نضجت. مع أدلة دامغة أكثر الأخيرة مشيراً إلى أن ضخ منتثر داخل الأوعية جزيرة بعيدة عن مثالية، الثرب عادت إلى الظهور كموقع يحتمل أن تكون قيماً لزرع الخلايا.
الثرب (في شكل الحقيبة omental) يوفر مزايا نسبية على الكبد15،16. وفاسكولاريزيد جيدا والوصول إليها بسهولة. أنها تسمح لاسترجاع الاختلاس (إذا لزم الأمر) و/أو خزعة. هو تخفيض فترة الدماغية من ذوي الخبرة بالجزر الصغيرة مقارنة بالكبد، ويمكن أن يقبل الثرب نسبيا الجماهير الكبيرة من جزيرة ليلى التي لا يمكن إينترابورتالي، حيث ارتفاع في الضغط المدخل يمكن أن تسبب مضاعفات.
تم استخدام نموذج ماوس سينجينيك لزرع الأعضاء في البروتوكول باختبارها في الدراسة، وتوظيف C57BL/6 الفئران الذكور بين 6 – 8 أسابيع من العمر مع وزن جسم من 20 – 25 زاي جزيرة المستلمين صدرت السكري بحقنه واحدة من بالستريبتوزوتوسين مع جرعة من 250 الملكية الفكرية مغ/كغ. التعريفي مرض السكري يمكن أن تعتبر ناجحة إذا كان مستوى السكر في الدم من الماوس هو أكبر من 24 مليمول/لتر 48 ساعة بعد الحقن، ويظل فوق هذا المستوى لمدة 5 أيام على الأقل.
الجزر سينجينيك بمعزل عن البنكرياس المانحين مطابقة العمر اتباع أساليب سبق نشرها مع بعض التعديلات. وباختصار، كان حقن كولاجيناز المرارة بدلاً من القناة الصفراوية. وقد تم ذلك كتحسين لتيسير سهولة الحقن. وكان ضخ كولاجيناز متبوعاً بالحضانة، واختلال الأنسجة، كثافة الفصل التدرج واليد-الانتقاء للحصول على الجزر نقية. الجزر الصغيرة كانت مثقف بين عشية وضحاها في كمرل-1066 المتوسطة وتستكمل مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS) في قوارير T175 في 37 درجة مئوية، تحت الهواء-5% 95% CO2 قبل الزرع.
Protocol
Representative Results
Discussion
زرع جزيرة ليلى إلى الكبد عن طريق الوريد البابي هو الأكثر استخداماً طريقة لزرع جزيرة ليلى في البشر، ولكن لا تزال هناك شواغل السلامة والكفاءة مثل الوريد البابي تجلط الدم والكبد ذلك17. وتظهر الدراسات الأخيرة أن الثرب قد تكون بديلاً مناسباً للكبد، ولكن أكثر الاحتياجات البحثية تج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بعض الكتاب هذا العمل تدعمها جزئيا المنح المقدمة من الوطنية المفتاح R & د البرنامج الصيني (2017YFC1103704)، ومشروع سانمينغ الطب في شنتشن (SZSM201412020)، صندوق “ارتفاع المستوى الطبي الانضباط البناء من شنتشن” (2016031638)، شنتشن مؤسسة للعلوم والتكنولوجيا (JCJY20160229204849975، GJHZ20170314171357556، JCYJ20160425110110658)، مؤسسة شنتشن للصحة ولجنة تنظيم الأسرة (SZXJ2017021).
Materials
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200μl Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
References
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes research and clinical practice. 103 (2), 137-149 (2014).
- Bellin, M. D., et al. Potent Induction Immunotherapy Promotes Long-Term Insulin Independence After Islet Transplantation in Type 1 Diabetes. American Journal of Transplantation. 12 (6), 1576-1583 (2012).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. The lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Nilsson, B., Ekdahl, K. N., Korsgren, O. Control of instant blood-mediated inflammatory reaction to improve islets of Langerhans engraftment. Current Opinion in Organ Transplantation. 16 (6), 620-626 (2011).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, metabolic syndrome and obesity: targets and therapy. 7, 211 (2014).
- Shapiro, A. J., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Cantarelli, E., Piemonti, L. Alternative transplantation sites for pancreatic islet grafts. Current diabetes reports. 11 (5), 364 (2011).
- Cantarelli, E., et al. Murine animal models for preclinical islet transplantation: no model fits all (research purposes). Islets. 5 (2), 79-86 (2013).
- Beli, E., et al. Erratum to: CX3CR1 deficiency accelerates the development of retinopathy in a rodent model of type 1 diabetes. J Mol Med (Berl). 95 (5), 565-566 (2017).
- Hafner, J., et al. Regional Patterns of Retinal Oxygen Saturation and Microvascular Hemodynamic Parameters Preceding Retinopathy in Patients With Type II Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (12), 5541-5547 (2017).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nature Biotechnology. 35 (1), 82017 (2017).
- Voigt, M., et al. Prevalence and Progression Rate of Diabetic Retinopathy in Type 2 Diabetes Patients in Correlation with the Duration of Diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes. , (2017).
- Baidal, D. A., et al. Bioengineering of an Intraabdominal Endocrine Pancreas. New England Journal of Medicine. 376 (19), 1887-1889 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. , (2016).
- Berman, D. M., et al. Bioengineering the endocrine pancreas: intraomental islet transplantation within a biologic resorbable scaffold. Diabetes. 65 (5), 1350-1361 (2016).
- Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. Intraportal islet transplantation: the impact of the liver micro-environment. Transplant International. 30 (3), 227-238 (2017).
- Espes, D., et al. Rapid restoration of vascularity and oxygenation in mouse and human islets transplanted to omentum may contribute to their superior function compared to intraportally transplanted islets. American Journal of Transplantation. 16 (11), 3246-3254 (2016).
- Hajizadeh-Saffar, E., et al. Inducible VEGF expression by human embryonic stem cell-derived mesenchymal stromal cells reduces the minimal islet mass required to reverse diabetes. Scientific Reports. 5, (2015).
