Een uitgebreide Procedure voor de evaluatie van de prestaties In Vitro van de vermeende Hemangioblastoma Neovascularization met behulp van de kiemen Assay sferoïde
Summary
Dit artikel presenteert een uitgebreide procedure om te evalueren in vitro of klassieke tumor angiogenese in hemangioblastomas (HBs) en haar rol in de HBs bestaat. De resultaten wijzen op de complexiteit van de HB-neovascularization en suggereren dat deze gemeenschappelijke vorm van angiogenese slechts een aanvullende mechanisme in de HB-neovascularization is.
Abstract
De inactivering van het von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gen speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van de hemangioblastomas (HBs) binnen het menselijk zenuwstelsel (CNS). Echter zowel de cytologische oorsprong en het evolutieproces van HBs (inclusief neovascularization) blijven omstreden, en anti-angiogenese voor VHL-HBs, gebaseerd op de klassieke HB angiogenese, teleurstellende resultaten in de klinische proeven hebben opgeleverd. Een belangrijke belemmering voor de succesvolle klinische vertaling van anti-vasculaire behandeling is het ontbreken van een grondige kennis van neovascularization in deze vasculaire tumor. In dit artikel presenteren we een uitgebreide procedure om te evalueren in vitro of klassieke tumor angiogenese in HBs, evenals zijn rol in de HBs bestaat. Met deze procedure, kunnen onderzoekers nauwkeurig begrijpen de complexiteit van HB neovascularization en identificeren van de functie van deze gemeenschappelijke vorm van angiogenese in HBs. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om de meest veelbelovende anti-vasculaire therapie voor tumoren, die hoge translationeel potentieel tumoren behandeling of heeft voor medeplichtigheid in de optimalisatie van de anti-angiogenic behandeling van HBs voortaan vertalingen evalueren. De resultaten wijzen op de complexiteit van HB neovascularization en suggereren dat dit gemeenschappelijk formulier angiogenese slechts een aanvullende mechanisme in HB neovascularization is.
Introduction
Hemangioblastomas (HBs) zijn goedaardige vasculaire tumoren die uitsluitend binnen het menselijk zenuwstelsel (CNS) worden gevonden. Zij ontwikkelen bij patiënten met de ziekte van von Hippel-Lindau (VHL) of sporadische laesies. VHL-HBs zijn moeilijk te genezen door middel van de chirurgische behandeling als gevolg van de frequente herhaling en meerdere letsels die het gevolg zijn van deze genetische wanorde1. Hoewel de inactivering van het VHL tumor suppressor gen is beschouwd als de oorzaak van de tumorigenesis van VHL-HBs, blijven de cytologische oorsprong (met inbegrip van neovascularization) en het evolutieproces van HBs grotendeels controversiële2. Dus, een beter begrip van HB-neovascular biologische mechanismen kan voorzien nuttige inzichten in de strategieën van de meest veelbelovende anti-vasculaire VHL-HBs.
Recent onderzoek heeft gesuggereerd dat HB-neovascularization vergelijkbaar met de embryologic vasculogenese3,4,5 is. Klassieke vasculaire endotheliale-groeifactor (VEGF)-gemedieerde angiogenese die afkomstig is van het vasculaire endotheel en die wordt aangestuurd door VHL verlies van functie resulteerde in proliferatie en neovascular formatie, die is6uitgedaagd. In 1965, Cancilla en Zimmerman gevonden, met behulp van elektronenmicroscopie, die HBs afkomstig van het endotheel-7 zijn. Later bleek dat stromale cellen zijn afgeleid van vasoformative element8. In 1982 vonden Jurco et al. dat stromale cellen van endothelial oorsprong9. Dus veronderstelde we dat menselijke vasculaire endotheliale cellen de oorspronkelijke cellen van HB-neovascularization10 zijn. Hoewel het is beter om het gebruik van de primaire culturen uit HB-cellen afgeleid van VHL patiënten chirurgische ingrepen, onze vorige onderzoek aangegeven dat primaire culturen van HB niet stabiel zijn, en cellijnen gevestigde3niet kon worden. Bovendien, de primaire culturen in de 3D-omgeving kunnen niet identificeren de cytologische oorsprong van HB-neovascularization omdat zij de progenitoren van HB-vasculaire ingrediënten10,11 omvatten. Daarom, als een primitieve en klassieke model van endotheliale cellen, kunnen menselijke vasculaire endotheliale cellen (HUVEC) dienen als een alternatief cellulaire model voor HBs.
De gekiemde assay sferoïde is een nieuw model in weefsel engineering12,13. In deze paper, een 3D collageen gebaseerde coculture systeem in vitro met behulp van de sferoïde kiemen assay werd ontwikkeld, met een algemene doelstelling om te evalueren of klassieke tumor angiogenese in HBs, evenals zijn rol in de HBs bestaat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Meerdere velden van vasculaire biologie onderzoek werden onlangs, gestimuleerd door de studie van de angiogenic endotheel15. In dit artikel, ontwikkelden we een endothelial sferoïde kiemen techniek als een experimenteel model om te bestuderen van de vorming van het vaartuig dat afkomstig van het VHL-gen verlies van functie in gemanipuleerde endotheliale cellen is te identificeren van nieuwe kandidaat-moleculen van de angiogenic cascade. Tot de beste van onze kennis is dit het eerste verslag het a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Shanghai Comité van wetenschap en technologie (15411951800, 15410723200). De auteurs bedank Prof. YuMei Wen en Prof. Chao Zhao van de pathogene micro-organismen departement van Fudan Universiteit voor hun technische bijstand.
Materials
| human umbilical vein endothelial cell | Fudan IBS Cell Center | FDCC-HXN180 | |
| dulbecco’s modified eagle’s medium | Gibco | 11995040 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 26400044 | |
| PLKO.1-puro vector | Addgene | #8453 | |
| packing plasmid psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| envelope plasmid pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| 3D round-bottom 96-well plates | S-Bio | MS-9096M | |
| matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985-070 | reduced serum medium |
| 15-well plate | Ibidi | 81501 | Air bubbles in the gel can be reduced by equilibrating the μ–Slide angiogenesis before usage inside the incubator overnight |
| endothelial cell growth supplements | Sciencell | #1052 | |
| 10-cm culture dish | Corning | Scipu000813 | |
| Puromycin | Gibco | A1113802 | |
| typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| Automated Cell Counter System | BioTech | ||
| Image Analysis software | Winmasis | http://mywim.wimasis.com |
References
- Lonser, R. R., et al. von Hippel-Lindau disease. Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).
- Hussein, M. R. Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist’s viewpoint. Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).
- Ma, D., et al. Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche. Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).
- Zhuang, Z., et al. Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors. Sci Rep. 4, 4102 (2014).
- Glasker, S., et al. VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma. Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).
- Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).
- Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma. J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).
- Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells. Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).
- Jurco, S., et al. Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry. Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).
- Ma, D., et al. Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas. Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).
- Ma, D., et al. CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma. Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).
- Sharifpanah, F., Sauer, H. Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis. Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).
- Cai, H., et al. Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma. Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).
- Xu, J., et al. Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP. Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- D’Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease. Biomed Res Int. 2015, 126582 (2015).
- Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model. Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).
- Morin, K. T., Tranquillo, R. T. In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel. Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).
- Blacher, S., et al. Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour. PLoS One. 9 (5), 97019 (2014).
- Straume, O., et al. Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).
- Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch. Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).
- Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment. Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).
- Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice. Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).
- Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene. J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).
- Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753 (2012).
