Perfusable сосудистая сеть с моделью ткани в устройстве Microfluidic
Summary
Протокол описывает инженер perfusable сосудистой сети в сфероида. Окружающие микроокружения сфероида разрабатывается побудить ангиогенеза и подключить сфероида к микроканалов microfluidic устройства. Метод позволяет перфузии сфероида, который является долгожданный технику в трехмерном культур.
Abstract
Сфероиде (многоклеточных совокупности) рассматривается как хорошая модель живых тканей в организме человека. Несмотря на значительные улучшения в культурах сфероида perfusable сосудистой сети в сфероидов остается важнейшей задачей для долгосрочной культуры, необходимо поддерживать и развивать их функции, такие как выражения протеина и морфогенеза. Протокол представляет новый метод для интеграции perfusable сосудистой сети в пределах сфероида microfluidic устройства. Чтобы побудить perfusable сосудистой сети в сфероида, ангиогенных ростки, подключенных к микроканалов на сфероиде руководствовались используя ангиогенных факторов от человеческих легких фибробластов, культивируемых в сфероида. Ростки ангиогенных достиг сфероида, объединилась с эндотелиальных клеток, совместно культивируемых в сфероида и формируется непрерывный сосудистой сети. Сосудистой сети может perfuse интерьер сфероида без какой-либо утечки. Сконструированный сосудистой сети может далее использоваться в качестве маршрута для поставки питательных веществ и удаления отходов, имитируя циркуляцию крови в vivo. Этот метод предоставляет новую платформу в культуре сфероида сторону лучше перепросмотре живых тканей.
Introduction
Переход от монослойном культивировании (двухмерный) к трехмерной культуре мотивируется необходимость работы с моделями культуры, которые имитируют клеточных функций живых тканей1,2,3. Плоские и жесткие пластиковые субстраты, широко используется в культуре клеток не напоминают большую часть внеклеточных средах в человеческом теле. В самом деле многие исследования показывают, что трехмерная культуры воссоздать ткани конкретных архитектуры, механические и биохимических подсказки и связи ячеек, которые не наблюдались в обычных двумерных культуры4, 5,6,,78.
Мультиклеточные агрегат или сфероида, является одним из наиболее перспективных методов для реализации этой трехмерной культуры9,10. Клетки секретируют внеклеточного матрикса (ECM) и может взаимодействовать с другими в сфероида. Хотя некоторые другие биоинженерии подходы11,12,13,14, например, клеток укладки, успешно реплицировать пространственная сложность человеческого тела, эти подходы имеют только два или три виды клеток для облегчения анализа и сосредоточены на только одной функции органов-мишеней. В отличие от клеток в сфероидов подвергаются различные культуры среды в зависимости от их позиции в сфероида из-за разнородных поставки питательных веществ и кислорода и паракринными Аутокринный сигнальных молекул в сфероида. Эта особенность сфероидов частично имитирует в естественных условиях состояния культуры и включить клетки в сфероидов для создания гораздо более сложной, организованной ткани структуры в vitro чем те, которые культивировали в укладки ткани9, 15 , 16. Обратите внимание, что если сфероиде состоит из одного вида клеток, функции клеток в сфероида не равномерное вследствие неоднородной среды в сфероида. В последние несколько лет сфероиде культур позволило эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) или ткани резидентов стволовые клетки, чтобы имитировать в естественных условиях развития последовательностей и воссоздать мини органы как мозг17, печени18и почек19,20.
Несмотря на значительный прогресс в сфероида культуры техники по-прежнему проблематично культивирования большой сфероидов долгое время. В трехмерные ткани клетки должны быть расположены в пределах 150-200 мкм кровеносного сосуда из-за ограниченное количество кислорода и питательных веществ,21. Сосудистой сети в пределах сфероида необходимы для пилки обмена веществ между кровью и тканями в естественных условиях. Для достижения этой цели, другие группы совместно культивируемых эндотелиальных клеток с целевой ячейки22,,2324 или индуцированной дифференцировка плюрипотентных клеток в CD31-положительных клеток20. Тем не менее сообщил корабля как структуры не имеют открытые концы lumina на поставку кислорода и питательных веществ в центр сфероида. Чтобы имитировать сосудистой роль питают клетки в трехмерном культуре, открытого и perfusable сосудистой сети должны разрабатываться в сфероида.
В течение последних нескольких лет некоторые исследовательские группы в поле микротехники сообщили методы построить perfusable сосудистой сети, спонтанно формируется в устройстве microfluidic используя ангиогенных факторов от cocultured фибробластов клетки25 ,26. Эти сосудистой сети имеют аналогичные морфология с их коллегами в естественных условиях и может быть перестроен факторами окружающей среды, что делает их пригодными для подражая сосудистой функции в культуре сфероида. Цель настоящего Протокола заключается в строительстве perfusable сосудистой сети в сфероида, используя microfluidic платформа27. Microfluidic устройство изменяется от ранее сообщалось устройство25 , так что сфероиде могут быть включены. Направляя ангиогенных секреции от клетки фибробластов в сфероиде эндотелиальных клеток в микроканалов, ангиогенных ростки от микроканалов, анастамозные с сфероида и сформировали perfusable сосудистой сети. Этот метод позволяет прямой поставкой широкого круга веществ, таких как флуоресцентных молекул и микрометр шкала бусины в интерьер сфероиде, который обеспечивает основу для долгосрочной культуры ткани с сосудистой сети.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предыдущие доклады показывают, что hLFs выделяют коктейль из нескольких ангиогенных факторов, таких, как Ангиопоэтин-1, Ангиогенин, фактора роста гепатоцитов, превращая фактор роста α, фактора некроза опухоли и некоторые внеклеточного матрикса белки29, 30. Э…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана гребень JST (Грант № JPMJCR14W4), общества для поощрения от науки (JSP) KAKENHI (номер 25600060, 16K 16386 Грант), центр инновационной программы от МПКСНТ и JST, проект был сосредоточен на разработке технологии оценки ключ от Японское агентство для медицинских исследований и развития, AMED, Mizuho Фонд содействия развитию наук. Микротехнологий поддержали Киотский университет нано технологии концентратора.
Materials
| AutoCAD 2017 | Autodesk | AutoCAD 2017 | |
| A chromium mask coated with AZP 1350. | CLEAN SURFACE TECHNOLOGY | CBL2506Bu-AZP | |
| Micro pattern generator | Heidelberg | uPG101 | |
| MF CD-26 developer | Rohm and haas electronic materials | – | Developer in protocol 1.4 |
| S-Clean | Sasaki Chemical | S-24 | Chromium etchant in protocol 1.5 |
| Aceton | Wako | 012-00343 | |
| Silicon Wafer | Canosis | SiJ-4 | |
| Spin Coater | MIKASA | 1H-D7 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Tokyo Ohka Kogyo | H0089 | |
| SU-8 3050 | MicroChem | – | Negative photoresist in protocol 1.9 |
| UV Exposure | Nanometric Technology Inc | LA310s | |
| SU-8 Developer | MicroChem | Y020100 | Developer for the negative photoresist in protocol 1.13 |
| 2-propanol | Wako | 163-04841 | |
| Surhace profiler | Vecco | Veeco Dektak XT-S | |
| (Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Toray | 184W/C | |
| Biopsy Punch (1.0mm) | Kai Industries | BP-10F | |
| Biopsy Punch (2.0mm) | Kai Industries | BP-20F | |
| Plasma System | Femto Science | COVANCE | |
| Cover glass | MATSUNAMI GLASS | C024241 | |
| Culture Dishes | Iwaki | 1000-035 | |
| RFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001RFP | |
| Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3162 | |
| Fibroblast Growth Media Kits | Lonza | CC-3132 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wako | 168-23191 | |
| 0.05w/v% Trypsin-0.53mmol/l EDTA• 4Na Solution with Phenol Red | Wako | 204-16935 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salts) | Takara bio | T900 | |
| 96-well plate | Sumitomo bakelite | 631-21031 | |
| 1000ul Chip | NIPPON Genetics | FG-402 | |
| 200ul Chip | NIPPON Genetics | FG-301 | |
| 10ul Chip | NIPPON Genetics | 37650 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Model 370 | |
| GFP Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cell | Angio Proteomie | cAP-0001GFP | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma | A6279 | |
| Collagen I | Corning | 354236 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma | T4648 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H21492 | Fluorescent dye to stain nuclei in protocol 5.5 |
| Paraformaldehyde Solution | Wako | 163-25983 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX71 | |
| Degital CCD Camera | OLYMPUS | ORCA-R2 | |
| Confocal Laser Scanning Biological Microscope | OLYMPUS | FV1000 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | OLYMPUS | IX-83 | |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma | FD70S |
References
- Abbott, A. Cell culture: Biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Abu-Absi, S. F., Friend, J. R., Hansen, L. K., Hu, W. S. Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research. 274 (1), 56-67 (2002).
- Bissell, M. J., Radisky, D. C., Rizki, A., Weaver, V. M., Petersen, O. W. The organizing principle: microenvironmental influences in the normal and malignant breast. Differentiation. 70 (9-10), 537-546 (2002).
- Liu, Y., et al. Novel role for netrins in regulating epithelial behavior during lung branching morphogenesis. Current Biology. 14 (10), 897-905 (2004).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-U147 (2009).
- Torisawa, Y. S., Shiku, H., Kasai, S., Nishizawa, M., Matsue, T. Proliferation assay on a silicon chip applicable for tumors extirpated from mammalians. International Journal of Cancer. 109 (2), 302-308 (2004).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Sutherland, R. M. Cell And Environment Interactions In Tumor Microregions – The Multicell Spheroid Model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Rothbauer, M., Zirath, H., Ertl, P. Recent advances in microfluidic technologies for cell-to-cell interaction studies. Lab on a Chip. , (2017).
- Matsuura, K., Utoh, R., Nagase, K., Okano, T. Cell sheet approach for tissue engineering and regenerative medicine. Journal of Controlled Release. 190, 228-239 (2014).
- Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 248-260 (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), (2014).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373 (2013).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481 (2013).
- Taguchi, A., et al. Redefining the In Vivo Origin of Metanephric Nephron Progenitors Enables Generation of Complex Kidney Structures from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Auger, F. A., Gibot, L., Lacroix, D., Yarmush, M. L. . Annual Review of Biomedical Engineering. 15, 177-200 (2013).
- Inamori, M., Mizumoto, H., Kajiwara, T. An Approach for Formation of Vascularized Liver Tissue by Endothelial Cell-Covered Hepatocyte Spheroid Integration. Tissue Engineering Part A. 15 (8), 2029-2037 (2009).
- Kunz-Schughart, L. A., et al. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 290 (5), C1385-C1398 (2006).
- Rouwkema, J., De Boer, J., Van Blitterswijk, C. A. Endothelial cells assemble into a 3-dimensional prevascular network in a bone tissue engineering construct. Tissue Engineering. 12 (9), 2685-2693 (2006).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on a Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W., George, S. C. In Vitro Perfused Human Capillary Networks. Tissue Engineering Part C-Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
- Newman, A. C., et al. Analysis of Stromal Cell Secretomes Reveals a Critical Role for Stromal Cell-Derived Hepatocyte Growth Factor and Fibronectin in Angiogenesis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (3), 513 (2013).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. W. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion limits of an in vitro thick prevascularized tissue. Tissue Engineering. 11 (1-2), 257-266 (2005).
- Zheng, Y., et al. Angiogenesis in Liquid Tumors: An In Vitro Assay for Leukemic-Cell-Induced Bone Marrow Angiogenesis. Advanced Healthcare Materials. 5 (9), 1014-1024 (2016).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
