Volgende Endocardial weefsel mutaties via de cel Photoconversion in het Embryo van de zebravis
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de photoconversion van Kaede fluorescent proteïne in endocardial cellen van de levende zebrafish embryo waarmee het volgen van endocardial cellen tijdens de atrioventriculaire kanaal en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkeling .
Abstract
Tijdens de embryogenese, cellen ondergaan dynamische veranderingen in het gedrag van de cel, en ontcijferen van de cellulaire logica achter deze veranderingen is een fundamentele doelstelling op het gebied van de ontwikkelingsbiologie. De ontdekking en ontwikkeling van photoconvertible eiwitten hebben ons begrip van deze dynamische veranderingen sterk geholpen door het verstrekken van een methode om optisch Markeer cellen en weefsels. Terwijl photoconversion, time-lapse microscopie en latere beeldanalyse hebben bewezen als zeer succesvol in het blootleggen cellulaire dynamiek in organen zoals de hersenen of het oog, wordt deze aanpak echter in het algemeen niet gebruikt in de ontwikkelingslanden hart wijten aan uitdagingen van de snelle beweging van het hart tijdens de cardiale cyclus. Dit protocol bestaat uit twee delen. Het eerste deel beschrijft een methode voor photoconverting en vervolgens endocardial cellen (EdCs) bijhouden tijdens zebrafish Atrioventriculaire kanaal (AVC) en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkeling. Bij deze methode wordt tijdelijk stoppen van het hart met een geneesmiddel om nauwkeurige photoconversion plaatsvinden. Harten zijn toegestaan om te hervatten gewonnen na verwijdering van de drug en de embryonale ontwikkeling blijft normaal totdat het hart weer voor hoge resolutie beeldvorming van photoconverted EdCs op een moment later ontwikkelings tijd wordt gestopt. Het tweede deel van het protocol beschrijft een methode van de analyse van het beeld om te kwantificeren van de lengte van een photoconverted of niet-photoconverted gebied in de AVC in jonge embryo’s door het toewijzen van het fluorescerende signaal van de driedimensionale structuur naar een tweedimensionale kaart . Samen, de twee delen van het protocol kan men de oorsprong en werking van cellen waaruit de zebravis AVC en Atrioventriculaire hartklep, en potentieel kan worden toegepast voor het bestuderen van mutanten, morphants of embryo’s die zijn behandeld met te onderzoeken reagentia die AVC en/of klep ontwikkeling verstoren.
Introduction
De zebravis is momenteel een van de belangrijkste gewervelde modellen om te studeren cellulaire en ontwikkelingsbiologie processen in vivo. Dit is grotendeels te wijten aan de de zebravis optische transparantie en inschikkelijkheid aan genetics, waardoor het een krachtig model voor de toepassing van optische technieken met genetisch photoresponsive eiwit technologieën1gecodeerd. Specifiek voor de studie van hart ontwikkeling, zebravis ontvangen voldoende zuurstof via diffusie zodanig dat zelfs mutanten zonder hartslag kunnen overleven door middel van de eerste week van ontwikkeling, het toelaat van analyses over de gevolgen van ontwikkelingsstoornissen genen en verstoord doorbloeding op hart voedselproductie niet mogelijk is in de meeste gewervelde dieren2.
De zebravis hart buis wordt gevormd door 24 uur bericht bevruchting (hpf). Kort na haar oprichting begint de hart-buis actief te verslaan. Door 36 hpf, een duidelijke vernauwing scheidt het atrium van het ventrikel. Deze regio van de vernauwing wordt aangeroepen op een cuboidal morfologie3de atrioventriculaire kanaal (AVC), en de cellen in deze regio wijziging vanuit een squamous morfologie. Zebravis Atrioventriculaire ventiel morfogenese begint ongeveer 48u post bevruchting. Door 5 dagen na de bevruchting, twee ventiel folders uit te breiden naar de AVC en de terug stroom van bloed vanuit het ventrikel aan het atrium tijdens de cardiale cyclus4voorkomen. Bijhouden van cellen tijdens de vorming van AVC en ventiel is een uitdaging zoals de snelle kloppen van het hart maakt het moeilijk om te volgen van cellen via traditionele time-lapse microscopie5,6. Dit protocol, aangepast van Steed et al., 20167, beschrijft een methode die gebruikmaakt van de GS (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafish transgene lijn, waarin de photoconvertible proteïne Kaede wordt uitgedrukt in endotheliale cellen, met inbegrip van het endocard. De drug 2,3-butaandion-2-monoxime (DTB) wordt gebruikt om tijdelijk stoppen met het hart gewonnen, waardoor nauwkeurige photoconversion van EdCs tussen 36 en 55 hpf en hoge resolutie beeldvorming van photoconverted EdCs op specifieke tijdstippen voor ontwikkelingsstoornissen. Het is eerder aangetoond dat EdCs photoconverted using zulks werkwijze voor vijf dagen of meer na de tijd van photoconversion7te onderscheiden van hun onbekeerde buren kan blijven. Dit protocol gegevens ook een methode die wordt gebruikt voor beeldanalyse van photoconverted EdCs in embryo’s jonger dan 48 hpf, die met succes is gebruikt om het weefsel bewegingen volgen tijdens AVC ontwikkeling (Boselli et al., in druk)9. Wij hopen dat lezers dit protocol nuttig vindt zou voor de studie van AVC en ventiel ontwikkeling in normale embryo’s, en mutanten, morphants of drug-behandelde embryo’s. Voor een meer algemene protocol betreffende cel bijhouden met behulp van photoconvertible eiwitten tijdens de ontwikkeling van de zebravis, te bekijken gelieve het artikel door Lombardo et al., 201210.
Protocol
Representative Results
Discussion
Timing van photoconversion: Hoewel Kaede blijft helder uitgedrukt in EdCs zelfs bij 96 hpf, opgemerkt moet worden dat als het embryo groeit, laserlicht meer diffundeert voordat zij de AVC tot, beperkte photoconversion van Kaede moeilijker te maken. At embryonale stadia later dan 55 hpf, het ballonvaren van het ventrikel en het atrium betekent ook dat de paarse laserstraal gebruikt voor photoconversion AVC cellen zonder eerste doorsnijdt het atrium of de ventrikel niet bereiken. Dit betekent dat voorbij 55 hpf, o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij wil Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli en Basile Gurchenkov bedanken voor het helpen bij het ontwerpen en maken van de mal beschreven in dit protocol. Dit werk werd gesteund door de ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), de EMBO jonge onderzoeker programma, FRM (DEQ20140329553), de EUROPESEGEMEENSCHAP, ERC CoG N ° 682938 Evalve en door de subsidie ANR-10-LABX-0030-INRT, een Franse staat Fonds beheerd door het Agence Nationale de la Recherche onder het frame programma Investissements d’Avenir label ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. . Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
