Summary

Incorporación de pericitos en un grano de célula endotelial brotación ensayo

Published: February 16, 2018
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Summary

Presenta protocolo una novela en vitro la tira de ensayo más modelos adecuadamente el proceso de en vivo brotación angiogénesis mediante la incorporación de pericitos. Esta modificación permite el ensayo de grano más fielmente recapitular las interacciones celulares heterotípicos entre las células endoteliales y las células murales que son críticas para la angiogénesis.

Abstract

Angiogénesis es la formación de nuevos vasos de vasculatura preexistente y es un componente importante de muchos procesos biológicos, incluyendo la embriogénesis y desarrollo, la cicatrización de heridas, crecimiento tumoral y metástasis y enfermedades oculares y cardiovasculares. Se necesitan modelos eficaces en vitro que recapitulan la biología de la angiogénesis adecuadamente este proceso de estudio e identificar mecanismos de regulación que pueden ser objeto en definitiva de nuevas estrategias terapéuticas. El análisis de la angiogénesis de grano ha demostrado previamente para recapitular las etapas múltiples de brotes endoteliales in vitro. Sin embargo, una limitación de este ensayo es una falta de endotelial – interacciones célula mural, que son fundamentales para la regulación molecular y fenotípica de células endoteliales función en vivo. El protocolo aquí presenta una metodología para la incorporación de las células murales en el ensayo de grano angiogénesis y muestra una asociación estrecha de las células endoteliales y pericitos durante brotación in vitro. El protocolo también detalla una metodología eficaz silenciamiento de genes de la blanco usando siRNA en las células endoteliales para estudios mecanísticos. En conjunto, este protocolo proporciona un análisis en vitro que más apropiadamente modelos de los tipos de células distintos implicados en brotes de angiogénesis y proporciona una plataforma más fisiológicamente relevantes para la evaluación terapéutica y nuevo descubrimiento de mecanismos de regulación de la angiogénesis.

Introduction

Angiogénesis es vital para la embriogénesis apropiado y la cicatrización de heridas, y también desempeña papeles claves en numerosas enfermedades incluyendo cáncer progresión1 y la arteria coronaria de la enfermedad. 2 , 3 tener una mejor comprensión de cómo se produce la angiogénesis en el desarrollo normal, y cómo se reactiva en contextos patológicos, es fundamental para el desarrollo de la novela, la terapéutica eficaz. Modelos fieles en vitro que recapitulan las etapas importantes y tipos de células implicados en la angiogénesis en vivo son necesarios para permitir que los investigadores mejor caracterizar los mecanismos moleculares conduce angiogénesis y hacer nuevos descubrimientos en la regulación endotelial.

Nakatsu y Hughes han optimizado un ensayo de grano brotes que han demostrado sufre el conocido muchas etapas de brotación angiogénesis. 4 , 5 el propósito del método presentado aquí es aprovechar el análisis optimizado por Nakatsu y Hughes con la incorporación de perictyes en el ensayo, para que las funciones paracrinas y juxtracrine de mural células en células endoteliales brotación pueden ser incorporadas en estudios de novela de la angiogénesis. Pericitos son células murales que se definen por su función como células que mantienen contacto físico con las células endoteliales debido a ser incrustados en la membrana basal vascular. 6 células endoteliales y pericitos participan en complejo la diafonía mediante vías incluyendo muesca de señalización señalización, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ y muchos otros. 7 , 8 modelos de ratón deficientes en estas vías de señalización demuestran pericyte pobre cobertura del desarrollo de la vasculatura en la embriogénesis, conduce a la remodelación vascular pobre y disfuncional vasculatura. 7 además, el papel del pericitos en la angiogénesis patológica es importante pero a menudo subestimada. Por ejemplo, una característica única de la vasculatura del tumor es que los vasos son más inmaduros, con fugas y disfuncional debido a la pobre pericyte cobertura. 9 se ha propuesto que la presencia o ausencia del pericitos dramáticamente afecta el fenotipo de los vasos sanguíneos tumorales y es un importante mediador de las respuestas a las terapias antitumorales y antiangiogénicos. 9 así, incluyendo el papel del pericitos en ensayos en vitro es clave captar más completamente los mecanismos importantes de regulación endotelial.

Aunque hay muchos ensayos in vitro y ex vivo actualmente empleados para estudiar la angiogenesis, hay defectos a considerar en cada uno. Algunos, como la proliferación endotelial y ensayos de migración endotelial, son excesivamente simplificados y se centran en una función endotelial en un entorno aislado en cultivo de tejidos de plástico. 10 otros ensayos ocurren en un entorno (3D) tridimensional 3 más, como el ensayo de formación de tubo de Matrigel,10 pero estos ensayos son todavía excesivamente y centran más en la capacidad de las células endoteliales migran y forman de novo vascular estructuras, en lugar de brotar de la vasculatura preexistente. Además, ninguno de estos ensayos incorporan tipos celulares mural. Hay ex vivo la modelos tales como el ensayo de aorta anillo que incorporan pericitos presentes en el órgano anfitrión, pero manipulación genética de estos modelos es mucho más difícil debido a la necesidad de generar modelos transgénicos o knockout del ratón de la rutas de interés. El grano del ensayo de germinación es ideal porque modelos brotación endotelial, proliferación, migración y formación incluso anastomosis y lumen en una matriz 3D. 4 el ensayo fielmente permite evaluación mecanicista de las muchas diferentes etapas de rebrote, permitiendo aún la modificación genética directa del pericitos en un entorno más controlado o de las células endoteliales. Los coágulos de fibrina que contiene los granos brotes pueden fácilmente fijarse, manchados y reflejados en las diferentes etapas de brotación; Estos brotes pueden también colocarse en una cámara de proyección de imagen vivo para realizar la proyección de imagen en tiempo real de las brotaciones. La metodología presentada aquí es ideal para el estudio de mecanismos básicos de la angiogénesis en fenotipado de profundidad y un análisis exhaustivo de las vías que se activan durante la angiogénesis.

Protocol

Día 1: 1. transitorios de la transfección de las células endoteliales Si lo desea, realizar una transfección transitoria de humano Umbilical vena Endothelial células (HUVEC) usando oligonucleótidos gene-regulatorios (por ejemplo micro-ARN o ARN interferente pequeño (siRNA)) y el reactivo lipofectamine apropiado según instrucciones del fabricante.Nota: Este protocolo ha tenido gran éxito realizando inversas transfecciones con secuencias de siRNA …

Representative Results

Este protocolo permite una estrecha asociación de la dos celda tipos in vitro, y la presencia del pericitos complementa la ocurrencia de brotes (figura 1A, B). El protocolo también permite la eficaz silenciamiento (p. ej. mediante ARN de interferencia) de un gen de interés en un tipo de células de interés como (VEGFA específicamente en las células endoteliales) o PDGFRβ en pericitos7,</su…

Discussion

Este protocolo presenta un método para la caracterización de las etapas complejas e interacciones celulares heterotípicos de brotación angiogenesis por lo que permite al investigador a emplear enfoques genéticos y proyección de imagen completa investigaciones mecanicistas. Cuando se realiza el ensayo, es esencial que eficiente recubrimiento endotelial de los granos ocurre durante la cuenta pasos de agitación. Pobre capa endotelial se hará evidente, si los granos no aparecen tienen una superficie áspera de la bol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los Drs. Victoria Bautch y Joshua Boucher para discusiones útiles y asesoramiento en la optimización de cuentas estándar brotación las condiciones analíticas y una brotación prueba de protocolo de tinción. S.H.A. fue apoyado en parte por una subvención de la Instituto Nacional de General médica Ciencias bajo concesión de GM007092 de 5T32.

Materials

Sterile Pipette tips VWR
Pipettors Eppendorf
Complete EGM2 Media Bullet Kit Lonza CC-3162 HUVEC Media
MEM Gibco 11095114 10T1/2 Media
DMEM Gibco 11965118 NHLF Media
Tissue culture-grade PBS Gibco 14190-144 Magnesium and calcium free
Accutase Life Technologies A1110501 For lifting HUVEC
Trypsin Life Technologies 15050065 For lifting 10T 1/2 and NHLF
Customs siRNAs Sigma
Lipofectamine RNAiMax Life Technologies 13778150
HUVEC Lonza C2517A
10T 1/2 ATCC
NHLF ATCC
Cytodex 3 microcarrier beads Sigma C3275
Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates Corning
Fibrinogen from bovine plasma Sigma F8630
Thrombin Sigma t9549
Aprotinin Sigma a3428
Falcon Round-Bottom Tubes Corning
Tissue culture incubator and hood
24-well glass bottom plates MatTek P24G1.513F Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable.
Sterile Filtration Device

References

  1. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
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Cite This Article
Azam, S. H., Smith, M., Somasundaram, V., Pecot, C. V. Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay. J. Vis. Exp. (132), e57309, doi:10.3791/57309 (2018).

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