本方案介绍了一种新型 体外 更适当地模拟该过程的珠式分析法 体内 通过引入周细胞来模拟出芽性血管生成。该改进使微球实验能够更真实地重现血管生成过程中内皮细胞与血管壁细胞之间关键的异质性细胞相互作用。
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本文内容
摘要
摘要
血管生成是指从已有血管中形成新血管的过程，是多种生物过程的重要组成部分，包括胚胎发生与发育、伤口愈合、肿瘤生长与转移，以及眼部和心血管疾病。有效 体外 需要能够重现血管生成生物学特性的模型，以恰当地研究这一过程，并鉴定出可作为新型治疗策略靶点的调控机制。珠状血管生成实验已被证实可重现内皮细胞出芽的多个阶段。 体外 然而，该检测方法的一个局限性在于缺乏内皮细胞与壁细胞之间的相互作用, 这对于内皮细胞功能的分子和表型调控至关重要 体内本方案介绍了一种将壁细胞整合到微珠血管生成实验中的方法，并展示了在出芽过程中内皮细胞与周细胞之间的紧密关联。 体外该方案还详细阐述了在内皮细胞中利用siRNA有效沉默目标基因以进行机制研究的方法。总体而言，本方案提供了一套完整的 体外 一种更适于模拟出芽型血管生成过程中多种细胞类型的检测方法，并为血管生成调控机制的治疗评估和新发现提供了更具生理相关性的研究平台。
引言
血管生成对于正常的胚胎发育和伤口愈合至关重要，同时在多种疾病（包括癌症进展）中也发挥着关键作用1 以及冠状动脉疾病。2,3 深入了解血管生成在正常发育过程中的发生机制，以及其在病理条件下如何被重新激活，对于开发新型且有效的治疗手段至关重要。忠实 体外 能够重现血管生成过程中关键阶段和细胞类型的模型 体内 有助于研究人员更深入地表征驱动血管生成的分子机制，并在内皮调控领域取得新发现。
中村和休斯优化了一种出芽微珠实验方法，该方法已被证实能够经历出芽性血管生成的多个已知阶段。4,5 本方法旨在通过将周细胞引入Nakatsu和Hughes优化的实验体系，进一步研究血管壁细胞在内皮细胞出芽过程中所发挥的旁分泌和邻分泌作用，从而为新型血管生成研究提供支持。周细胞是一类血管壁细胞，其特征在于能够与内皮细胞保持紧密的物理接触，这是因为它们嵌入于血管基底膜中。6 周细胞与内皮细胞通过包括 Notch 信号通路、Ang-Tie2、PDGFRβ、TGFRβ 以及许多其他信号通路进行复杂的相互作用。7....
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方案
第1天：
1. 内皮细胞的瞬时转染
- 如需进行，可使用基因调控寡核苷酸（例如 micro-RNAs 或小干扰 RNA (siRNA)）及适当的脂质体转染试剂，按照制造商说明书对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行瞬时转染。
注意：本方案在使用定制 siRNA 序列和商用转染试剂进行反向转染时取得了良好效果（参见材料表）。作者未测试其他转染方案和试剂与本实验的兼容性。使用所列试剂进行反向转染的步骤如下： - 用无核酸酶水将冻干的 siRNA 或 microRNA 重悬至浓度为 20 µM。
- 按以下比例配制转染溶液：每 1 mL 无血清培养基中加入 9 µL siRNA 或 microRNA。
- 轻轻振荡溶液，并于室温孵育 5 分钟。
- 向溶液中加入 18 µL 转染试剂，振荡混匀。
- 将溶液于室温孵育 20–40 分钟，在孵育期间每隔 10 至 15 分钟振荡一次。
- 在转染溶液孵育的同时，使用细胞解离液（例如 Accutase）消化 HUVEC。对于 T175 培养瓶，先用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后加入 5 mL 细胞解离液，于 37 °C 孵育 10 分钟。
- 向 T175 培养瓶中加入 5 mL 完全培养基，收集细胞悬液并以 ....
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结果
该方案可实现两种细胞类型之间的紧密关联 体外 周细胞的存在补充了出芽现象的发生（图1A，B）。该方案还能实现有效的沉默（例如 通过RNA干扰技术在特定细胞类型中对目标基因进行敲低（例如在内皮细胞中特异性敲低VEGFA，或在周细胞中特异性敲低PDGFRβ）7,12 在实验过程中，这可能导致出芽表型受到抑制。建议使用本方案的研究人员同时进行标准的仅含内皮细胞的出芽实验，以更全面地探究周细胞在所研究的血管功能和表型中的独特作用。
为获得能够充分包被且在纤维蛋白凝胶中稳定出芽的微珠（图2A、B），必须严格遵守本方案中所述的实.......
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讨论
本方案介绍了一种通过使研究者能够运用遗传学和成像方法进行深入的机制研究，来表征出芽型血管生成过程中复杂阶段及异质性细胞间相互作用的方法。在进行该实验时，关键在于珠粒振荡步骤中必须实现内皮细胞对珠粒的有效包被。如果次日早晨在凝胶植入前珠粒表面未呈现出类似高尔夫球的粗糙外观，而是显得完全光滑，则表明内皮细胞包被效果不佳。在每次振荡过程中，应确保充分重悬珠粒，通过剧烈振荡离心管使珠粒表面最大程度地暴露于内皮细胞，但振荡力度不宜过大，以免导致已附着的内皮细胞从珠粒上脱落。
在将周细胞加入实验时，必须维持5个内皮细胞与1个周细胞的比例。周细胞过多会导致其在实验过程中过度生长并取代内皮细胞群体，而周细胞不足则会导致血管覆盖不充分。如果细胞密度适当但仍观察到周细胞对血管的覆盖不佳，可能需要调整与周细胞共孵育的时间。不建议调整细胞数量。另一种方法是仅用内皮细胞包被微珠4小时，然后通过重悬微珠和细胞溶液并在微珠沉降后、细胞沉降前移除培养基，从而将内皮细胞从培养体系中去除，随后加入周细胞，并每隔20分钟振荡一次，持续额外1小时。
将包被的微珠嵌入.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Victoria Bautch 博士和 Joshua Boucher 博士在优化标准微珠出芽实验条件及出芽实验染色方案方面提供的有益讨论和建议。 S.H.A. 的研究部分由美国国家普通医学科学研究所资助，资助编号为 5T32 GM007092。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无菌移液器吸头 | VWR | ||
| 移液器 | Eppendorf | ||
| EGM2完全培养基弹药包试剂盒 | Lonza | CC-3162 | HUVEC培养基 |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2培养基 |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF培养基 |
| 组织培养级PBS | Gibco | 14190-144 | 无镁和钙 |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | 用于消化HUVEC细胞 |
| 胰蛋白酶 | Life Technologies | 15050065 | 用于消化10T1/2和NHLF细胞 |
| 定制siRNA | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3微载体珠 | Sigma | C3275 | |
| 组织培养包被的6 cm和10 cm培养皿 | Corning | ||
| 牛血浆来源纤维蛋白原 | Sigma | F8630 | |
| 凝血酶 | Sigma | t9549 | |
| 抑肽酶 | Sigma | a3428 | |
| Falcon圆底管 | Corning | ||
| 组织培养用孵育箱和超净台 | |||
| 24孔玻璃底培养板 | MatTek | P24G1.513F | 仅当需要对出芽结构进行成像时才需使用玻璃底培养板；若无需成像，使用组织培养级塑料培养板亦可。 |
| 无菌过滤装置 |
参考文献
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M.
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