Questo articolo viene descritto un metodo per analizzare il contenuto delle cellule immuni del tessuto adiposo tramite isolamento delle cellule immuni dal tessuto adiposo e l’analisi successiva usando la citometria a flusso.
Infiltrazione di cellule immunitarie nel tessuto adiposo sottocutaneo e viscerale (a) depositi conduce ad un’infiammazione che contribuiscono allo sviluppo di complicanze associate all’obesità come il diabete di tipo 2. Indagare quantitativamente e qualitativamente i sottoinsiemi delle cellule immuni in umani presso depositi, abbiamo sviluppato un approccio di citometria a flusso. La frazione vascolare stromal (SVF), contenente le cellule immuni, è isolata dal sottocutaneo e viscerale alle biopsie da digestione della collagenosi. Adipociti vengono rimossi dopo la centrifugazione. Le cellule SVF sono macchiato per più marcatori di membrana-limiti selezionati per differenziare tra sottoinsiemi delle cellule immuni e analizzati mediante citometria a flusso. Come risultato di questo approccio, pro – e anti – infiammatorie del macrofago sottoinsiemi, cellule dendritiche (DCs), B-cellule, CD4+ e CD8+ T-cellule, e le cellule NK possono essere rilevate e quantificate. Questo metodo fornisce informazioni dettagliate su cellule immunitarie in AT e la quantità di ogni sottoinsieme specifico. Poiché esistono numerosi anticorpi fluorescenti disponibili, il nostro approccio di citometria a flusso può essere regolato per misurare vari altri marcatori cellulari e intracellulari di interesse.
L’obesità è caratterizzata con qualità inferiore AT infiammazione1 e infiltrazione di cellule immuni pro-infiammatorie sia viscerale e sottocutaneo a (IVA, sabato). Accumulazione delle cellule immuni pro-infiammatorie nel tino conduce all’insulino-resistenza, che è un fattore di rischio primario per lo sviluppo di tipo 2 il diabete2. Le cellule immuni del sistema immunitario innato e adattivo si trovano in AT obesi, come macrofagi, mastociti, neutrofili, CD4+ e CD8+ le cellule T e B-cellule3,4,5,6 ,7. Queste cellule immuni, insieme con le cellule endoteliali, cellule stromali, progenitori degli adipociti, fibroblasti e periciti, costituiscono la SVF8 e sono la principale fonte di sostanze pro-infiammatorie nel AT9.
Lo stato infiammatorio di AT è comunemente studiato mediante tecniche di Western blot10, qPCR11e immunohistochemistry11. Tuttavia, quando si utilizzano queste tecniche, l’intero AT, adipociti e SVF, viene utilizzato. Questo rende difficile determinare l’importo e sottoinsiemi di cellule immunitarie presenti nell’AT. Cellule del sistema immunitario hanno vari indicatori delle cellule per definire e categorizzare loro, quali i macrofagi. I macrofagi mostrano eterogeneità significativa sia in funzione e in cella di espressione di superficie dell’indicatore12. Pertanto, essi sono spesso classificati nelle due popolazioni di macrofagi: M1 e M2. I macrofagi m2 sono di solito chiamati macrofagi attivati in alternativa12,13 e risiedono nell’AT di magra, metabolicamente normali esseri umani14. Tuttavia, durante l’obesità, un interruttore fenotipico si verifica dai macrofagi M2 ai macrofagi M1. Questi classicamente attivati M1 macrofagi express CD11C12 e si accumulano nei dintorni di adipociti morti per formare strutture simili a corona13. È stato dimostrato che CD11C+ macrofagi in AT compromettere l’azione dell’insulina e sono associati con insulino-resistenza in esseri umani obesi15. Per identificare i macrofagi M1 e M2 in AT, immunohistochemistry è un’opzione. Questa tecnica dà informazioni sulla posizione dei macrofagi nel tessuto. Tuttavia, essa limiterà il numero di marcatori che possono essere utilizzati in una colorazione. Inoltre, è anche difficile da quantificare. Pertanto, per studiare i sottoinsiemi delle cellule immuni differenti nella IVA e depositi sAT, abbiamo sviluppato un approccio di citometria a flusso. Questo approccio ci dà l’opportunità di utilizzare più marcatori per cella con analisi di citometria a uno flusso per definire sottoinsiemi di cellule e contare i numeri di ogni sottoinsieme presenti nei depositi di AT.
Questi metodi descrivono come isolare la SVF dall’IVA e seduti e quantificare la quantità relativa di cellule immuni all’interno di questi tessuti. Inoltre, i metodi di stato come determinare l’espressione di marcatori su tipi cellulari specifici.
Citometria a flusso delle cellule immuni del tessuto è una tecnica potente per fenotipo lo stato immunologico dei tessuti. La quantificazione delle cellule immuni del tessuto può avere molte applicazioni. Come descritto nei risultati, è possibile confrontare la presenza di cellule immuni specifiche tra gruppi di pazienti (ad es., magra vs obesi). Inoltre, eseguendo anche citometria a flusso su sangue degli stessi pazienti, associazioni tra linfociti circolanti e le cellule del tessuto possono essere studiate. Con questa applicazione, siamo stati in grado di determinare che uno specifico sottoinsieme di monociti circolanti è associato con pro-infiammatorie CD11C+ tessuto adiposo macrofagi16.
Adattamenti del protocollo descritto si espanderanno le sue applicazioni come numerosi anticorpi fluorescenti disponibili rendono molto versatile la citometria a flusso. Con anticorpi differenti si possono distinguere quasi tutti i tipi di cellule e l’espressione di molti marcatori possa essere rilevato. Inoltre, è possibile a macchiare marcatori intracellulare di permeabilizing la membrana cellulare per consentire l’associazione intracellulare degli anticorpi fluorescenti. Queste caratteristiche permettono una distinzione tra le popolazioni molto diverse del macrofago oltre i sottotipi di macrofago eccessivamente semplificati M1 e M2. Oltre alla misurazione dell’espressione di superficie dell’indicatore, proteine (cioè, citochine) possono essere macchiate intracellulare che fornisce informazioni sulla funzionalità del macrofago. Inoltre, gli indicatori di proliferazione come Ki67 vengono utilizzati per quantificare i tassi di proliferazione. Come descritto, distinzione tra macrofagi e DCs era basato su livelli MFI di marcatori di DC. Un indicatore del macrofago generali, come ad esempio CD68 può essere incorporato nel pannello del macrofago (FACS pannello 1). Tuttavia, CD68 deve essere macchiato intracellulare che richiede permeabilizzazione della membrana cellulare che non è preferibile e si estenderebbe il protocollo. Altri marcatori del macrofago sono indicatori di sottoinsieme quali CD163 e CD206 o CD11c, quest’ultimo integrato nel pannello del macrofago presentato qui.
Nei nostri pannelli FACS, un marcatore di distinguere cellule vivi e morte non è stato incluso, che sarebbe preferibile perché permette una più accurata esclusione di cellule morte che l’uso di FSC e SSC. Frequentemente utilizzati è il DNA macchiatura attuabilità coloranti propidio ioduro (PI) o 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) così come ammina libera reagendo coloranti come il LIVE/DEAD risolvibile Dead Cell Stain Kit, che è disponibile in colori diversi della tintura. Tuttavia, PI e DAPI non può essere utilizzato quando le cellule di fissaggio. Come descritto nel protocollo, la colorazione di attuabilità LIVE/DEAD risolvibile Red Dead Cell può essere integrata in entrambi i pannelli senza intaccare il FACS complessiva strategia di gating.
Inoltre, i dati sono espressi come percentuale di cellule vive, che significa che tutti i dati sono relativi. Solo inserendo un esatto, noto il numero di celle nel citometro a flusso, sarebbe possibile determinare i numeri esatti di ogni tipo di cellula. Un numero approssimativo delle cellule potrebbe essere calcolato dopo contando le cellule nella frazione SVF utilizzando una camera di conteggio. Tuttavia, questo numero deve essere regolata per la quantità di tessuto di biopsia utilizzato per isolare la SVF, ma questo ha limitazioni quando si confrontano le magra per obesi a. Una massa simile di obesi AT è costituito da meno adipociti come essi sono pieni di lipidi e hanno ampliato notevolmente. Questo potrebbe portare ad una sottovalutazione del numero delle cellule immuni se presentato come numero di cellule immuni per grammo di a o per adipociti.
Negli studi umani, l’inclusione dei pazienti è fatto solitamente per un periodo più lungo di tempo rendendo la standardizzazione delle procedure sperimentali di grande importanza. Per il confronto dei dati di cytometry di flusso tra pazienti, ci sono diverse opzioni. Come descritto in questo protocollo, le cellule possono essere fissate prima misurazione consentendo analisi di parecchi campioni nello stesso giorno. Ciò può anche essere ottenuto congelando il SVF prima che li macchia, che consente la procedura di colorazione essere uguale tra tutti i campioni, ma la vitalità delle cellule potrebbe essere influenzata. Infine, anche impiegato in questo studio, sono perline fluorescenti per installare i livelli retributivi e citometro rilevamento delle sfere sono stati utilizzati bi-settimanale per standardizzare le misurazioni giornaliere del citometro. Quest’ultima opzione è la più efficiente quando si misura campioni da uno studio che attraversa un lungo periodo di tempo.
Un fattore limitante per citometria a flusso è in generale l’uso della fluorescenza. Il numero di etichette fluorescenti che possono essere rilevati contemporaneamente è limitato a causa della sovrapposizione negli spettri di emissione. Tuttavia, con sviluppo di pannello smart FACS e l’uso di diversi cocktail di anticorpi per IVA o campione sAT, questo problema può essere superato, come descritto in questo protocollo. Un aspetto importante dello sviluppo del pannello di FACS è FMO controlli. Utilizzando tutti gli anticorpi del pannello ad eccezione di uno, potenziali livelli di autofluorescence possono essere apprezzati quando si confrontano il FMO con pannello completo. In questo modo accurato gating delle popolazioni e queste procedure devono essere eseguite quando si configura un nuovo pannello di FACS. Nuove generazioni di dispositivi FACS è inoltre in grado di rilevare fino a 50 parametri che permettono la rilevazione simultanea di molte caratteristiche per cella. Un altro problema correlato all’aspetto di fluorescenza è l’autofluorescenza delle cellule, in particolare i macrofagi. Dopo l’eccitazione delle cellule con il laser di FACS (principalmente con 488 nm lunghezza d’onda di eccitazione), queste cellule emettono un segnale fluorescente (principalmente < 640 nm) che può sovrapposizione con lo spettro di emissione dell'anticorpo etichette17,18. Per tenere conto di questo, non macchiate le cellule dovrebbero essere misurate per determinare l’autofluorescenza in ciascun canale. Con questa conoscenza, dovrebbero essere selezionati fluorocromi che visualizzano un segnale che supera il segnale di autofluorescent. Questo segnale di fondo di autofluorescent dovrebbe tener conto quando si determina la strategia di gating delle popolazioni. Di conseguenza, dall’applicazione del presente protocollo e intelligente design del pannello di FACS è possibile nei sottotipi di profondità fenotipo del macrofago. Nuova AT distinti macrofagi e la loro funzione può essere caratterizzati.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare J. van de Gaar e M. Vroomen (Università di Maastricht, Paesi Bassi) per il loro supporto tecnico. Inoltre, vorremmo ringraziare K. Verboven, D. Hansen, J. Antonio, e Blaak E. per la fornitura di biopsie del tessuto e del sangue utilizzati per l’impostazione di questo protocollo e gli esperimenti successivi.
Centrifuge | Hettich Rotanta 460R | 5660 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)-Ham’s F12 | Gibco ThermoFisher | 31330-095 | |
Collagenase XI from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657-1g | |
Collagenase I from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1g | |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25 | |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | |
Bovine Serum Albumine | Sigma Aldrich | A4503-100 | |
NaN3 | Merck | 1.06688.0100 | |
200 µM syringe Filcons | BD Biosciences | 340613 | |
70 µM filter | Greiner Bio-one | 542070 | |
Fc block / human IgG | Sigma Aldrich | 14506 | |
Formaldehyde | Merck | 1.04003.2500 | |
CD11b-BV421 | Biolegend | 301324 | |
CD19-Fitc | BD Biosciences | 555412 | |
CD3-Fitc | BD Biosciences | 561807 | |
CD66b-Fitc | BD Biosciences | 555724 | |
CD56-Fitc | BD Biosciences | 562794 | |
CD11c-APC-Cy7 | Biolegend | 337218 | |
CD45-PE-Cy7 | BD Biosciences | 557748 | |
CD19-BV421 | Biolegend | 302234 | |
CD3-V500 | BD Biosciences | 561416 | |
CD56-APC | Biolegend | 318310 | |
CD4-PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 300528 | |
CD8-APC-H7 | BD Biosciences | 641400 | |
CD303-PE | Biolegend | 354204 | |
CD141-APC | Biolegend | 344106 | |
FACS-Canto II | BD Biosciences | ||
96 v-shape well plate | Greiner Bio-one | 651101 | |
PBS PH 7.4 | Gibco ThermoFisher | 10010023 | |
FACS tube 5 mL polystyrene round-bottom tube | Corning | 352052 | |
IgG from human serum | Sigma Aldrich | I4506 | |
Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552844 | |
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD Biosciences | 552843 | |
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L23102 | |
IKA MS 3 basic shaker | Sigma Aldrich | Z645028-1EA |