用末端转移酶介导的 dUTP 尼克末端标记 (Caspase 3/7) 测定青蛙壶菌病的表皮细胞死亡
Summary
我们用两种方法定量测定青蛙壶菌病的表皮细胞死亡。首先, 我们使用终端转移酶介导的 dUTP 尼克末端标签 (隧洞)的原位组织学, 以确定临床感染和未感染动物之间的差异。其次, 用 caspase 3/7 蛋白分析方法对感染细胞凋亡进行时间序列分析。
Abstract
两栖动物在全球范围内的生物多样性遭受巨大损失, 其中一个主要原因是传染病壶菌病。这种疾病是由真菌病原体Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) 引起的, 它感染和扰乱了青蛙表皮;然而, 病理变化没有明确的特征。细胞凋亡 (程序性细胞死亡) 可以被病原体用来损伤宿主组织, 但也可以成为病原体去除抗病的宿主机制。在这项研究中, 我们用两种不同的化验方法来量化感染和未感染动物的表皮细胞死亡: 末端转移酶介导的 dUTP 尼克末端标签 (caspase 3/7)。采用腹壁、背侧和大腿皮肤组织, 观察临床感染动物的表皮细胞中的细胞死亡, 并用荧光显微术比较未感染动物的细胞死亡. 为了确定表皮细胞凋亡水平在感染过程中的变化情况, 我们在8周的时间里去掉脚趾头的样本, 并使用提取的蛋白质 caspase 3/7 化验来量化样品中的活动。然后, 我们将 caspase 3/7 活动与感染负荷相关联。该方法对细胞死亡的局部化有很大的作用就地, 但成本高昂, 且每次取样时间密集。caspase 3/7 法对大样本量和时间过程实验有很高的效率。然而, 由于青蛙脚趾尖端活检是小的, 有有限的提取物可用于样本标准化通过蛋白质量化方法, 如布拉德福德化验。因此, 我们建议通过对脚趾活检的摄影分析来估计皮肤表面积, 以避免在样品标准化过程中消耗提取物。
Introduction
两栖动物目前正在经历一个最大的损失全球生物多样性的任何脊椎动物分类1。这些下降的主要原因是致命的皮肤病壶菌病, 由真菌病原体 Batrachochytrium dendrobatidis, Bd 2 引起.病原体表面上感染表皮, 这可能导致皮肤功能的破坏, 导致严重的电解质丧失, 心跳骤停, 死亡3。目前正在研究针对Bd的各种潜在宿主免疫机制, 例如抗菌肽4、5、皮肤细菌菌群6、免疫细胞受体7、8、和淋巴细胞活动9,10。然而, 很少有研究探讨表皮细胞凋亡和细胞死亡是否是对抗这种致命病原体的免疫机制。
细胞死亡, 无论是通过凋亡 (程序性细胞死亡) 或坏死 (unprogrammed 死亡), 在表皮可能是病理学的Bd感染。先前的研究表明, Bd感染可能诱导细胞凋亡, 因为当皮肤外植体暴露在游动孢子上清液体内 11 中时, 细胞内结的破坏就会被观察到。此外, 在Bd感染的青蛙的变性表皮变化观察使用电子显微镜12,13。Transcriptomic 分析表明, 凋亡通路是上调在感染皮肤14, 两栖脾发生凋亡时, 他们暴露在Bd上清液在体外15。尽管越来越多的证据表明, Bd可以诱导细胞凋亡和宿主细胞死亡体外,在体内研究, 探索或量化凋亡机制, 通过感染的进展缺乏。此外, 不知道宿主是否使用凋亡作为防御性免疫策略来对抗Bd感染, 或者如果凋亡是疾病的病理学。
在本研究中, 我们的目的是通过两种方法来检测感染动物的表皮细胞死亡和细胞凋亡: caspase 3/7 蛋白测定, 以及末端转移酶介导的 dUTP 尼克末端标签 (隧洞) 原位测定。由于每种检测都检测到细胞死亡的不同方面16, 这些方法一起提供了对细胞死亡所涉及的机制的充分理解, 并确保准确测量效果。caspase 3/7 的分析量化了效应半胱氨酸蛋白酶3和7的活动, 这使得定量的内在和外在的凋亡途径。与此相反, 该方法检测 DNA 碎片, 这是由细胞死亡机制, 包括凋亡, 坏死和 pyroptosis17造成的。我们使用三种不同的皮肤部位: 背部、温特和Pseudophryne corroboree的大腿, 利用该方法对临床感染和未感染动物表皮内的细胞死亡位置进行调查。该方法确定细胞死亡的解剖部位, 并鉴别其在特定表皮层内的位置。然后, 我们使用 caspase 3/7 检测在Litoria verreauxii 阿尔宾娜中对整个8周的感染进行时间序列的细胞凋亡量化。我们从相同的动物两周的脚趾提示样本, 并能够关联病原体感染负荷与 caspase 3/7 活动。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们探讨了表皮细胞凋亡和细胞死亡作为一种潜在的病理机制的致命疾病壶菌病或机制的抗病能力的Bd 敏感物种。我们使用两种方法评估表皮细胞死亡, 对原位表皮细胞死亡分析的 caspase 法, 以及在整个感染过程中监测表皮细胞死亡的3/7 项试验。我们发现, 细胞死亡和凋亡与感染负荷相关, 细胞死亡在感染部位明显增高。早期感染时, 表皮细胞凋亡减少, 但随着感染组织内病原菌负担的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢下列协助畜牧和收集数据的人: d. Tegtmeier、c. Fossen、波斯富、m. 麦克威廉姆斯、l. Bertola、斯图尔特、n 哈尼和 t Knavel;和 m. Merces 协助解剖。我们还要感谢 m. 麦克法登、哈洛和塔隆加动物园提高低压阿尔宾娜和 g. Marantelli 以提高 P. corroboree。我们感谢 f. Pasmans, a. 马特尔关于细胞凋亡化验的建议, 康斯坦丁, Kladnik 和韦伯的帮助与隧洞化验, t Emeto 和 W. Weßels 的帮助与协议和试剂盒 caspase 3/7 化验。此手稿和协议从 Brannelly et 2017对等 J22中改编而成.
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
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