将套管植入啮齿动物的麦格纳池中
Summary
在这里, 我们描述了一个协议, 以执行麦格纳插管 (CMc), 一种微创的方式, 提供示踪剂, 基质和信号分子进入脑脊液 (CSF)。结合不同的成像方式, CMc 使 glymphatic 系统和脑脊液动力学评估, 以及大脑范围内的各种化合物的交付。
Abstract
大池插管 (CMc) 是一个简单的程序, 使直接进入脑脊液 (CSF) 没有手术损伤的头骨或脑实质。在麻醉啮齿目动物中, 硬脑膜通过颈部肌肉的钝夹层暴露, 使套管插入到麦格纳 (CM) 的池中。套管由细斜面针或硼硅酸盐毛细管组成, 通过聚乙烯 (PE) 管连接到注射器。使用注射器泵, 分子可以直接注射在控制速率的 CM, 这是连续的蛛网膜下腔。从蛛网膜下腔, 我们可以通过对流流的周围空间来追踪脑脊液的通量, 从而产生与间质流体的溶质交换。CMc 可在手术后立即注射, 或用于慢性植入, 随后注射麻醉或清醒, 自由移动啮齿动物。定量的示踪剂分布在脑实质可以由荧光, 2 光子显微术, 磁共振成像 (MRI), 根据物理化学性质的注射分子。因此, CMc 结合各种成像技术, 为评估 glymphatic 系统和脑脊液动力学和功能提供了有力的工具。此外, CMc 可以作为一个管道, 快速, 大脑范围内传递的信号分子和代谢基质, 否则不能通过血脑屏障 (BBB)。
Introduction
脑脊液 (CSF) 将中枢神经系统 (CNS) 沐浴在整个心室系统和蛛网膜下腔内, 这是一个解剖上定义的空间在连续体与脑室, 围绕大脑和脊髓。脑脊液的主要功能之一是提供从脑实质中清除代谢物和溶质的途径。通过最近发现的 glymphatic 系统1, 将大脑模拟到外围淋巴系统, 方便了清除。在这里, 我们描述和讨论的是一个微创的方法, 以直接提供分子进入脑脊液池的麦格纳插管 (CMc)。CMc 是研究 glymphatic 功能的关键方法。此外, CMc 也可以应用于脑脊液动力学研究和快速, 大脑范围内的非血脑屏障 (BBB) 渗透分子进入脑实质, 沿周围空间。
CMc 通过中枢神经系统利用脑脊液运动动力学的生理原理, 将标记的示踪分子或药物传送到麦格纳池 (CM) 的脑脊液填充空间。分子通过插入到寰枕硬脑膜膜内的套管注入, 覆盖厘米. 然后通过 paravascular 空间1, 将脑脊液散装流进入脑实质。通过 CMc 注射的示踪剂或造影药剂跟随脑脊液的运动, 它允许评估脑脊液运动和 glymphatic 的流入, 量化的强度水平的标记分子进入大脑实质。CMc 兼容不同的成像技术, 包括荧光, 2 光子显微术, 磁共振成像 (MRI)。此外, 可以在体内或前体中执行此评估。重要的是, CMc 允许 glymphatic 系统的可视化在麻醉下或在自然睡眠期间, 并且在醒的, 自由地移动的动物。
CMc 技术可用于研究脑脊液中流体动力学的不同方面, 但已证明对研究 glymphatic 系统特别有用。Glymphatic 活动通过 aquaporin-4 (AQP-4) 水通道在胶质血管包裹 endfeet 的膜中拴在 periarterial 空间中, 推动脑脊液的对流流动。对流流使脑脊液和间质流体在脑实质中相互交换。通过 perivenous 空间2,3, 将含有代谢废物和溶质的 CSF 从脑实质中移除。最终, CSF 通过最近描述的硬脑膜淋巴管到达外围,4,5。对于清除有害废物代谢物 (如淀粉样蛋白β2), glymphatic 系统已被证明是至关重要的。进一步, glymphatic 清除在老化6, 在创伤性脑损伤以后7, 并且在糖尿病的动物模型8和阿尔茨海默病9。值得注意的是, glymphatic 活动是状态依赖性的, 在睡眠或麻醉中显示的活动显著高于清醒的1。事实上, 年轻的麻醉动物表现出最高的 glymphatic 活动。因此, 在研究其在健康和疾病中的作用时, glymphatic 活动的实验量化是至关重要的。
几项研究已经讨论了脑脊液动力学及其与间质流体的交换在脑实质。然而, 标记的分子被提供的方法是相当侵入性的, 触发脑实质损伤和颅内压的变化 (ICP) (见回顾10)。一些例子是脑室内或脑实质注射, 涉及开颅手术或钻孔在头骨的一个毛刺孔。这些过程已被证明可以改变 ICP, 从而中断 glymphatic 函数2。此外, 这种侵入性方法诱发 astrogliosis 和增加 AQP-4 免疫反应在脑实质受损地区及其周围的11,12。由于星形胶质细胞和 AQP-4 是 glymphatic 系统的关键元素, CMc 是其研究的选择方法。CMc 与更多侵入性程序相比, 其主要优点是保持完整的颅骨和脑实质, 避免 ICP 改变和 astrogliosis。因此, CMc 与不同的成像工具一起打开了广泛的可能性, 不仅研究 glymphatic 系统, 而且还有流动的动力学和机制的动态平衡, 以及动物模型的神经系统疾病。
该池 (CMc) 程序允许容易和直接进入脑脊液 (CSF)。通过注射不同的分子 (例如荧光示踪剂, MRI 造影药), 实验者可以跟踪他们的运动在脑脊液室和评估 glymphatic 系统的活动。下面的协议描述了急性 CMc, 在手术后立即注射, 和慢性套管植入, 其中动物从手术过程中恢复为以后注射。急性和慢性植入的最重要的区别是慢性植入允许研究醒鼠的 glymphatic 活动。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们已经提出了一个协议, 描述了一个详细的程序, 一池的麦格纳插管 (CMc) 提供了一个简单的方法, 提供标签的分子到脑脊液室。CMc 允许随后的脑脊液动力学可视化, 无论是在体内和前体,使用不同的成像方式或组织学。
CMc 技术的主要优点之一在于它可以直接进入蛛网膜下腔, 而无需通过开颅手术暴露大脑。通过不需要颅骨窗口或大脑实质的穿透针尖, CMc 允许分子…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了诺德基金会和国立神经疾病和中风研究所 (M.N.) 的支持。a.l.r. x 和 S. R 是博士后奖学金的接受者和 Lundbeck 基金会的博士学位。
Materials
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
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