Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)
Summary
Burada, LC/MS analizi ile birleştiğinde lazer yakalama mikrodiseksiyon dağınık şekilde ölçmek-akciğer tüberkülozu granülomlar içinde uyuşturucu dağıtımı için bir iletişim kuralı’nı açıklar. Yaklaşım ilaç konsantrasyonları yüksek uzaysal detay dokularda miktarının için geniş uygulanabilirliği vardır.
Abstract
Tüberküloz hala morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen bir nedenidir. İlerleme-e doğru mevcut uyuşturucu rejimleri ve roman therapeutics gelişimi şiddetle ihtiyaç vardır. Ulaşmak ve bakteri kötü skarların nekrotik bölgeler (caseum), pulmoner granülomlar içinde sterilize etmek için biraz dozlayıp TB uyuşturucu başarılı terapötik müdahale için çok önemli bir özelliğidir. Etkili tedavi rejimleri bu nedenle uyuşturucu ile olumlu caseum penetrasyon özellikleri içermesi gerekir. Biyolojik dokuların seviyelerinde ilaç miktarının geçerli LC/MS yöntemler sınırlı Uzaysal çözünürlük yetenekleri, doğru küçük doku bölmeleri içinde bulunanlar gibi içinde mutlak ilaç konsantrasyonu belirlemek üzere nekrotik granülomlar. Burada lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) patolojik olarak farklı doku bölgeleri LC/MS miktar ile birleştiren bir iletişim kuralı mevcut. Bu teknik granuloma caseum, hücresel lezyon ve ilişki kurmadan Akciğer doku çevreleyen içinde ilaçların mutlak miktar sağlar ve bu nedenle, doğru bir şekilde bakterisidal konsantrasyonları elde olup olmadığını belirler. Tüberküloz araştırma ek olarak, teknik hastalıklı dokularda dağınık şekilde çözülmüş miktar uyuşturucu için birçok potansiyel uygulamalar var.
Introduction
Dağınık şekilde çözme ve ilaç düzeyleri ölçmek özelliğini Anti-tüberküloz ilaçlar bakteriyel altgrupları konsantrasyonları1sterilize, akciğer lezyonları içinde ulaşmak olup olmadığını belirlemek için çok önemli bir gereksinimdir. Belirli önemi uyuşturucu penetrasyon (caseum denir) lezyon genellikle basiller en yüksek sayısını içerir ve ilaçlara vaskülarizasyon yokluğu nedeniyle erişilebilir olabilir nekrotik çekirdek içine belirliyor.
Homojenizasyon eksize pulmoner lezyonların dahil lezyon penetrasyon, değerlendirmek için geleneksel yöntemleri ardından solvent ekstraksiyon ve sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LC/MS) analizi, son derece hassas ve uyuşturucu için seçici faiz. Ancak, bu yöntemleri özgün homojenize doku boyutunu sınırlı yoksul mekansal bilgi sunuyoruz. Kütle spektrometresi tabanlı görüntüleme yaklaşımlar, matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonlaşma (maldı)2,3gibi electrospray iyonlaşma (DESI)4 ya da yüzey çıkarma sıvı gelişmiş5desorption, 6 teklif görüntüleme yetenekleri son derece dağınık şekilde çözüldü, ama doğrudan miktar son derece zor ya da imkansız heterojen iyon bastırma etkileri ve çeşitli hücreden analit farklı ayıklama verimliliği nedeniyle olabilir veya doku7türleri. Ayrıca, en doğrudan doku MS görüntüleme yaklaşımlar doğal olarak daha az LC/MS iyonlaşma ve uyuşturucu dokusundan daha düşük solvent ekstraksiyon verimliliği için rekabet endojen türlerin Kromatografik ayırma eksikliği nedeniyle daha duyarlıdır.
LC/MS analizi ile kombine lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yalıtmak ve proteomik8,9 çalışmalar için farklı doku bölgeleri karakterize için rutin olarak uygulanan ve son zamanlarda uyuşturucu miktar için kullanılan içinde ilaç hayvan doku10. Burada en iyi duruma getirilmiş bir protokol farklı Granülom bölmeleri içinde anti-TB uyuşturucu ölçmek için LCM LC/MS (LCM-LC/MS) analizi ile birlikte uygulama mevcut. Lazer yakalama mikrodiseksiyon işlemi bir UV lazer ile mikroskop objektif keser ve kullanıcı tarafından tanımlanan bir yolu takip ederek istenilen doku alan izole doku bölümü üzerine odaklanmıştır. Yerçekimi destekli LCM için (Bu araştırma için kullanılan teknik), doku bölümü (PET veya kalem) bir ince polimer membran slayt monte edilir ve doku slayt oturtulmuş bir koleksiyon tüp şapkalı yakalanır. Uyuşturucu eksize dokudan ayıklanır ve standart LC/MS yaklaşımları kullanarak sayılabilir. Doku toplanması için gerekli miktarı sonuçta dokuda mevcut uyuşturucu beklenen konsantrasyonu ve LC/MS yöntemi duyarlılık belirlenir. Terapötik düzeyde ilaç ve bir rutin triple quadrupole Kütle Spektrometre, 3 milyon µm2 (3 mm2) dokusunun kullanılarak analiz ilaçların çoğu analizleri için yüzey alanı yeterlidir.
Bu iletişim kuralı kayma profil oluşturma güçlü bir kombinasyon açıklar ve mutlak ilaç konsantrasyonları TB granülomlar bütün bölümler içinde sağlayan tam miktar LCM-LC/MS tarafından sunulan. Teknik aynı zamanda birçok farklı hastalıklı dokuları hayati ilaç bulma ve geliştirme bilgi veren konsantrasyonlarda uyuşturucu belirlemek için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dağınık şekilde çözülmüş miktar akciğer TB lezyonlar içinde ilaçların ilaç pozlama sterilize konsantrasyonları bakteriyel nüfus farklı lezyon bölmeleri içinde ikamet eden ulaşır olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Burada açıklanan LCM-LC/MS yöntemi kullanarak yalnızca 1-3 doku bölümleri toplam bakteri açısından zengin caseum de dahil olmak üzere bütün lezyon bölümler içinde anti-TB ilaçların mutlak miktar sağlar. Geleneksel doku homojenizasyon ve LC/MS yaklaşımlar iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Paul O’Brien, Marizel Mina ve Isabella Freedman hayvan deneyleri için Jacquie Gonzalez ve Danielle Weiner NIH/NIAID dan önce lazer yakalama mikrodiseksiyon ve Jansy Sarathy tavşan doku el yazması için gama ışınlama ile yardım için teşekkür düşünce ve tavsiye. Bu eser Bill’den fon tarafından desteklendi ve Melinda Gates Vakfı (OPP1174780) ve paylaşılan NIH araçları 1S10OD018072 verin. Eliseo A. Eugenin Leica LMD 6500 mikroskop erişim sağlayan ve uzmanlık ve tavsiye paylaşımı için teşekkür ederiz. Satın alma ve devam eden desteğiyle LMD 6500 Ulusal Enstitüsü ruh sağlığı grant, MH096625, sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur, NS105584, PHRI (E.A.E) finansman ve GSK katkılar (E.A.E) tarafından finanse edildi.
Materials
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
- Roscioli, K. M., et al. Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection. Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).
- Prideaux, B., et al. Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling. Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).
- Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections. Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).
- Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).
- Dilillo, M., et al. Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section. J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).
- Xu, B. J. Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications. Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).
- Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).
- Zimmerman, M., et al. Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).
- Kempker, R. R., et al. Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).
- Zhao, Y., et al. Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model. Antimicrob Agents Chemother. , (2017).
- Pascal, J., et al. Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response. ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).
