Summary

ביצוע, בדיקות ושימוש Microelectrodes סלקטיבית של יון אשלגן בפרוסות רקמת המוח למבוגרים

Published: May 07, 2018
doi:

Summary

יוני אשלגן לתרום פוטנציאל ממברנה מנוחתו של תאים, ריכוז K+ חוץ-תאי הוא מווסת מכריע של הסלולר דעתנית. אנו נתאר כיצד להפוך, לכייל ולהשתמש monopolar K+-microelectrodes סלקטיבית. באמצעות אלקטרודות כזה מאפשר מדידת דינמיקה ריכוז K+ חשמלית עורר בפרוסות בהיפוקמפוס למבוגרים.

Abstract

יוני אשלגן לתרום באופן משמעותי פוטנציאל ממברנה מנוחתו של תאים, לכן, ריכוז K+ חוץ-תאי הוא מווסת מכריע של התא דעתנית. שינו את ריכוזי משפיע על K+ חוץ-תאית את מנוחתו ממברנה פוטנציאליים וסלולריות דעתנית על ידי הסטה של שיוויי משקל בין מדינות סגור פתוח, מוחלש תעלות יונים תלוית מתח העומדים בבסיס פוטנציאל הפעולה חניכה, הולכה. . מכאן, זה חשוב למדוד ישירות את הדינמיקה K+ חוץ-תאית של הברית חולות ובריאות. כאן, אנו נתאר כיצד להפוך, לכייל ולהשתמש monopolar K+-microelectrodes סלקטיבית. אנחנו לפרוס אותם לפרוסות מוח בהיפוקמפוס למבוגרים כדי למדוד דינמיקה עורר חשמלית של ריכוז K+ . שימוש מושכל אלקטרודות כאלה היא חלק חשוב של ערכת הכלי הדרושים להעריך המנגנונים הסלולר ואת biophysical לשלוט ריכוזים K+ חוץ-תאית במערכת העצבים.

Introduction

ריכוז יון אשלגן מוסדרים בחוזקה במוח, תנודות שלהם השפעה חזקה על פוטנציאל ממברנה מנוחתו של כל התאים. לאור בתרומותיה קריטי, מטרה חשובה של ביולוגיה היא לקבוע את המנגנונים הסלולר ואת biophysical המשמשים בחוזקה לווסת את הריכוז של K+ בחלל חוץ-תאית באיברים שונים של גוף1 , 2. דרישה חשובה במחקרים אלה הוא היכולת למדוד ריכוזים K+ במדויק. למרות רכיבים רבים אשר תורמים אשלגן הומאוסטזיס במוח במצבים בריאים וחולים היה להיות מזוהה3,4,5, עוד התקדמות האיטה בשל אופי מיוחדות הכנת יון סלקטיבי microelectrodes למדידה אשלגן. חיישנים microelectrode מייצגים את תקן זהב למדידת K+ ריכוזים במבחנה, פרוסות רקמות ו vivo בתוך.

גישות חדשות יותר עבור K+ ניטור נמצאים בפיתוח באמצעות חיישנים אופטיים, אולם אלה לא זיהית ריכוזים של טווח רלוונטי מבחינה ביולוגית של K+ או לא נבדקו במערכות ביולוגיות, למרות תוצאות ראשוניות מופיעים6,מבטיח7,8. בהשוואה לחיישנים אופטיים, microelectrodes מוגבלות באופן מהותי מדידה נקודת המקור של יונים, למרות אלקטרודה מערכים יכול לשפר את הרזולוציה המרחבית9. מאמר זה מתמקד החיישנים microelectrode חד-קני לניטור K+ dynamics.

בעבודה זו, אנחנו מדווחים הליכים מפורטים stepwise כדי להפוך K+ microelectrodes סלקטיבית, באמצעות ionophore של אשלגן מבוססי valinomycin המתיר סלקטיבי מאוד (104 קיפול K+ ל נה+ סלקטיביות) K+ תנועת הקרומים10. מפוליפפטיד המתרחשים באופן טבעי, valinomycin פועל כמו נקבובית חדיר K+ ואסטמה ומקילה על הזרימה של K+ למטה. זה הדרגתי אלקטרוכימי. אנחנו גם מתארים כיצד לכייל את האלקטרודות, כיצד לאחסן ולהשתמש בהם, ולבסוף כיצד לפרוס אותם כדי למדוד דינמיקה ריכוז K+ מוח בהיפוקמפוס חריפה פרוסות של עכברים בוגרים. שימוש כזה אלקטרודות יחד עם עכברים מהונדסים שאין תעלות יונים וברצפטורים ספציפיים מוצע להסדיר את הדינמיקה K+ חוץ-תאית לחשוף את המנגנונים התאיים המשמשים את מערכת העצבים כדי לשלוט של החוק, K + ב חצרו חוץ-תאית.

Protocol

כל הניסויים נערכו על פי המכון הלאומי של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה ואושרו על-ידי ועדת המחקר של בעל חיים של הקנצלר ב אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג’לס. כל העכברים שוכנו עם מים ואוכל זמינים ad libitum בסביבה בהירה-כהה 12 שעות. כל בעלי החיים היו בריאים ללא שינויים התנהגותיים ב…

Representative Results

למדידה סלקטיבי של K חוץ-תאית+, הכנו microelectrodes סלקטיבית יון מצופה בשכבה הידרופובי דרך silanization של פיפטות זכוכית בורוסיליקט נקי (איור 1 א’). ציפוי זה מאפשר את ionophore K+ המכיל valinomycin לנוח בקצה האלקטרודה ולא להתיר רק K+ שטף דרך פתח צר בקצה אלקטרודה (<stron…

Discussion

השיטה שבה נתאר כאן אפשרה לנו להעריך K+ dynamics בתגובה גירוי חשמלי של שפר בהתקפה חריפה פרוסות בהיפוקמפוס של עכברים בוגרים. אופן הכנת K+ יון סלקטיבי microelectrodes דומה מוקדם יותר המתואר הליכים12,13,14,15. אולם, שיטה זו יש יתר…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המעבדה Khakh נתמכה על ידי NIH MH104069. המעבדה Mody נתמכה על ידי NIH NS030549. J.C.O. תודה את Grant(NS058280) של NIH T32 אימונים מתוכנת עצבית.

Materials

Vibratome DSK Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice Taconic Stock#B6
Microscope Olympus BX51
Electrode puller Sutter P-97
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2
pCLAMP10.3 Molecular Devices n/a
Custom microfil 28G tip World precision instruments CMF28G
Tungsten Rod A-M Systems 716000
Bipolar stimulating electrodes FHC MX21XEW(T01)
Stimulus isolator World precision instruments A365
Grass S88 Stimulator Grass Instruments Company S88
Borosilicate glass pipettes World precision instruments 1B150-4
A to D board Digidata 1322A Axon Instruments
Signal Amplifier Multiclamp 700A or 700B Axon Instruments
Headstage CV-7B Cat 1 Axon Instruments
Patch computer Dell n/a
Sodium Chloride Sigma S5886
Potassium Chloride Sigma P3911
HEPES Sigma H3375
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S0751
D-glucose Sigma G7528
Calcium Chloride Sigma 21108
Magnesium Chloride Sigma M8266
valinomycin Sigma V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene Sigma 40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate Sigma 60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane Sigma 85126-5ml
TTX Cayman Chemical Company 14964
Hydrochloric acid Sigma H1758-500mL
Sucrose Sigma S9378-5kg
Pipette Micromanipulator Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens Olympus PlanAPO 10xW

References

  1. McDonough, A. A., Youn, J. H. Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits. Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).
  2. Hille, B. . Ion channels of excitable membranes. , 507 (2001).
  3. Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina. J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).
  4. Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels. PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137 (2015).
  5. Tong, X., et al. Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington’s disease model mice. Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).
  6. Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor. Nanotechnology. 28 (32), 325502 (2017).
  7. Bandara, H. M. D., et al. Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor. J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).
  8. Depauw, A., et al. A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues. Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).
  9. Machado, R., et al. Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain. Biosensors. 6 (4), (2016).
  10. Rose, M. C., Henkens, R. W. Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin. Biochim Biophys Acta BBA – Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).
  11. Ammann, D., Chao, P., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).
  12. Amzica, F., Steriade, M. Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex. J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).
  13. Amzica, F., Steriade, M. The functional significance of K-complexes. Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).
  14. MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes. Glia. 37 (2), 114-123 (2002).
  15. Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice. J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).
  16. Hall, D. G. Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects. J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).
  17. Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. J Vis Exp. (103), e53058 (2015).
  18. Larsen, B. R., MacAulay, N. Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain. Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).
  19. Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).

Play Video

Cite This Article
Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. J. Vis. Exp. (135), e57511, doi:10.3791/57511 (2018).

View Video