Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine
Summary
Qui, presentiamo un metodo per progettare il genoma di c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine e modelli di omologia riparazione dipendente.
Abstract
Si ripete regolarmente sparpagliata palindromica cluster (CRISPR) – CRISPR – associati proteina 9 (Cas9) sistema di difesa immunitario adattivo prokaryotic ha stato cooptato come un potente strumento per l’ingegneria precisa del genoma eucariotico. Qui, presentiamo un metodo rapido e semplice utilizzando RNA chimerico guida singola (sgRNA) e CRISPR-Cas9 ribonucleoproteine (RNP) per la generazione efficiente e precisa di mutazioni genomiche di punto di c.elegans. Descriviamo una pipeline per selezione target sgRNA, disegno del modello di omologia-regia di riparazione (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complessante e consegna e una strategia di genotipizzazione che consente l’identificazione robusto e rapido degli animali correttamente modificati. Il nostro approccio non solo consente la facile generazione e l’identificazione del punto desiderato genomico animali mutanti, ma facilita anche la rilevazione di altri alleli complessi indel in circa 4-5 giorni con alta efficienza e un carico di lavoro ridotto lo screening.
Introduction
I recenti progressi tecnologici hanno radicalmente trasformato e accelerato la possibilità al proprio genoma di ingegnere. In particolare, il sistema CRISPR-Cas9, che si basa sull’endonucleasi di RNA-guida Cas9 per indurre una rottura del doppio filamento (DSB) vicino alla sequenza di destinazione di interesse, è stato ampiamente utilizzato per progettare accuratamente il genoma della maggior parte degli organismi di modello utilizzato in ricerca biomedica1,2,3,4. Significativamente, l’uso di CRISPR-Cas9 ha sbloccato l’editing genomico anche in specie difficili come elegans del c.5. Indipendentemente dalla specie, generando mutazioni puntiformi con il genoma di CRISPR-Cas9 basato sistema di editing si basa su tre componenti principali: 1) Cas9 endonucleasi, 2) una singola guida RNA (sgRNA) che indirizza l’endonucleasi Cas9 a una sequenza di destinazione e 3) un utente progettato modello di omologia-regia di riparazione (HDR) contenente la modifica desiderata in/he / di interesse2.
Ci sono diversi metodi che possono essere utilizzati per introdurre il targeting sgRNA e Cas9 nucleasi nelle cellule incluse plasmide e RNA virale basato consegna metodi6. Recentemente, consegna diretta di pre-complessati sgRNA-Cas9 ribonucleoproteine (RNP) è emerso come uno strumento potente ed efficace nel genoma basati su CRISPR-Cas97di editing. La consegna diretta di pre-complessati CRISPR-Cas9 RNP ha diversi vantaggi distinti, vale a dire: 1) RNP ignorare la necessità di trascrizione cellulare e traduzione, 2) RNP sono rapidamente eliminato, che può aumentare la specificità riducendo il tempo disponibile per fuori bersaglio fenditura e 3) RNP non contenere nessun elementi di DNA/RNA estranei che aggira l’introduzione delle sequenze non-nativi nel genoma ospite attraverso integrazione casuale. Insieme, questi attributi probabili forniscono una breve raffica di on target CRISPR editing riducendo al minimo gli effetti fuori bersaglio.
Descriviamo un protocollo semplice ed efficace per introdurre cambiamenti genomici site-specific in c. elegans. Questo protocollo include destinazione sgRNA e disegno del modello HDR singolo incagliato oligonucleotide (ssODN), sgRNA-Cas9 RNP complessante e consegna e una strategia di genotipizzazione per l’identificazione inequivocabile degli animali correttamente modificati. Utilizzando questa strategia, non solo possono essere recuperate le modifiche desiderate e site-specifiche, ma altre mutazioni indel non specifici possono anche essere recuperati. Così, la nostra strategia consente la generazione di una serie allelica usando una strategia unica, dove entrambi allelica mono, bi-allelica e indel mutanti possono essere generati nella generazione1 F.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema di CRISPR-Cas9 è uno strumento potente ed efficace per proprio modificando il genoma degli organismi modello. Qui, dimostriamo che chimerico sgRNAs20 accoppiato con ssODN HDR modelli permettono la generazione altamente efficiente di mutazioni genomiche di punto di c.elegans. D’importanza, dimostriamo che consegna RNP produce alta efficienza di editing quando fluorescenza viene utilizzato come un indicatore di co-selezione, mettendo in evidenza la facilità e l’affidabilità de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Non ci sono nessun conflitti di interesse relazionati alla presente relazione.
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
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