Summary
Här ger vi en billig och pålitlig metod för att generera electroporated hjärnan organotypic skiva kulturer från musembryon passar konfokalmikroskopi och live-imaging tekniker.
Abstract
GABAergic interneuroner (INs) är kritiska komponenter i neuronala nätverk som driver kognition och beteende. Moduler avsedda för att fylla cortex migrera tangentiellt från sin ursprungsort i den ventrala telencephalon (inklusive från de mediala och stjärtfenan ganglieblockerande eminenser (MGE, CGE)) till dorsala kortikala plattan som svar på en mängd av inre och yttre ledtrådar. Olika metoder har utvecklats under åren för att genetiskt manipulera specifika vägar och undersöka hur de reglerar de dynamiska cytoskeletal förändringar som krävs för korrekt i migration. In utero elektroporation har i stor utsträckning används för att studera effekten av genen förtryck eller överuttryck i specifika IN subtyper medan bedömningen av inverkan på Morfologi och slutliga ståndpunkt. Men medan detta tillvägagångssätt används lätt att ändra radiellt migrerar pyramidala celler, det är mer tekniskt utmanande när inriktning INs. In utero elektroporation genererar en låg avkastning ges minskad överlevnaden av pups när elektroporation görs före e14.5, som brukligt när man studerar MGE-derived INs. I ett alternativt tillvägagångssätt, MGE bladsticklingar ger enkel åtkomst till MGE och underlätta bildtagning av genetiskt modifierade INs. Dock i dessa bladsticklingar, INs migrera in en konstgjord matrisen, saknar endogena vägledning cues och thalamic ingångar. Detta föranledde oss att optimera en metod där INs kan migrera i en mer naturalistisk miljö, och kringgå de tekniska utmaningarna i livmodern metoder. I detta papper beskriver vi kombinationen av ex utero elektroporation av embryonala mus hjärnor följt av organotypic skiva kulturer lätt spåra, bild och rekonstruera genetiskt modifierade INs migrerar längs deras naturliga vägar att bemöta endogena ledtrådar. Detta tillvägagångssätt möjliggör både kvantifieringen av de dynamiska aspekterna av migration med time-lapse confocal imaging, samt en detaljerad analys av olika morfologiska parametrar med neuronala rekonstruktioner på fasta immunolabeled vävnad.
Introduction
Kortikala GABAergic interneuroner (INs) är olika när det gäller deras biokemiska egenskaper, fysiologiska egenskaper och anslutning, och de förmedlar olika funktioner i mogen nätverk1,2,3 ,4,5. Specifikationen av olika subtyper av kortikala INs är hårt reglerad genom genetiska kaskader som varit flitigt studerade1,2. Majoriteten (70%) av kortikala GABAergic INs härstammar från stamfäder i den mediala ganglieblockerande eminens (MGE), en ventralt ligger embryonal struktur, och måste migrera över relativt långa avstånd att nå den kortikala plattan1, 2 , 6. medan kortikala pyramidala celler migrerar radiellt från ventrikulära zonen (VZ) till kortikala plattan längs radiella glia schavotten, tangentiella migreringen av INs, som inte är kopplade till sådan en byggnadsställning, kräver en mängd inneboende och extrinsic ledtrådar att locka migrerar nervceller mot kortikala plattan, medan vägleda dem bort från icke-kortikala strukturer2,7,8. Efter spännande cellcykeln, INs stöts bort från MGE av chemo-motbjudande ledtrådar som uttrycks inom VZ av den MGE, som utlöser tangentiella migration mot de kortikala platta9,10. Migrera INs undvika striatum med hjälp av olika motbjudande cues11 och, efter att ha nått den kortikala plattan, de växla från en tangentiell till en radiell migreringsläge och nå sin slutliga laminar ståndpunkt, delvis som svar på signaler från pyramidal celler12 och andra cellulära populationer13. Migreringen av INs, när det gäller andra neuronala populationer, innebär olika dynamiska morfologiska förändringar för att tillåta den faktiska rörligheten av neuron. Denna s.k. neuronala locomotion kännetecknas av upprepade cykler av tre på varandra följande steg: förlängning av en ledande process, en aktiv anterograd rörelse av kärnan (nucleokinesis), och indragning av den efterföljande process14. I migration regleras av många inre och yttre ledtrådar som driver förgrening och aktiva omdaning av ledande processen att vägleda INs i rätt riktning, att fastställa både riktning och hastighet av migration14,15 ,16.
De bestämningsfaktorer som reglerar kortikala i migration har studerats i senaste åren1,2,7,17,18,19,20, och störningar i några av dessa molekylära aktörer har förutsatts för att leda till nervsystemets utveckling, såsom pediatric refraktär epilepsi eller autism spektrum störningar1,2,21, 22 , 23 , 24. därför, utveckling av olika in vitro- och in-vivo metoder har bedrivits för att betydligt förbättra vår förmåga att studera denna dynamiska process, som tidigare granskade25. In vitro- metoder, inklusive Boyden kammare analysen och Stripe val analysen, ger de snabbaste och mest reproducerbara medel utvärdera kravet och cell-autonom påverkan av specifika gener eller proteiner under neuronal migration, utan påverkan av andra faktorer25. Dessa analyser är särskilt användbara när de kombineras med live-imaging8,26,27. Med dessa tekniker, INs enkelt hämtas från e13.5 MGE och isoleras genom enzymatisk och mekaniska dissociation, varefter olika signalvägar och vägledning ledtrådar kan undersökas, vilket illustreras tidigare8,28 . Dock ske dessa analyser i en konstgjord extracellulära matrix i avsaknad av tredimensionella vävnad arkitektur, som kan förändra neuronala beteende och cell egenskaper, som potentiellt påverkar cell migration och/eller överlevnad25. För att kringgå dessa begränsningar, har ex vivo MGE bladsticklingar utvecklats som ett alternativt verktyg att kvantifiera de dynamiska morfologiska förändringar som sker under migreringen tillsammans med parametrar såsom hastighet och riktning14, 29. Generera MGE bladsticklingar är relativt enkel och har varit utförligt beskrivs på annan plats30. Det innebär plätering av ett litet utdrag av MGE på en enskiktslager av blandad kortikal celler eller i en blandning av matrigel och kollagen i närvaro av attraktiva eller repulsiva Biljardköer25, även om de senare är valfria31. MGE bladsticklingar möjliggör hög upplösning imaging av glest märkta celler, vilket förenklar studiet av intracellulära processer, såsom cytoskeletal remodeling under ledande processen förgrening, enligt den tidigare32,33 ,34 och i den aktuella studien. MGE bladsticklingar har använts framgångsrikt att bedöma dynamisk cytoskeletal förändringar under i migration i en 2D-miljö, till exempel efter specifika farmakologiska eller kemotaktisk manipulationer (se, till exempel Tielens et al. 201633) . Men med detta synsätt, INs migrera inom en konstgjord matris, och detta kan förändra beteende och reproducerbarhet och betydelsen av experimentella resultat.
Däremot i livmodern elektroporation möjliggör genetisk manipulering av INs i sin ursprungliga miljö och är en allmänt använd metod för att snabbt och effektivt bedöma effekterna av vinst och förlust av geners funktion medan kringgå begränsningarna med kostsamma och tidskrävande knockout och inpressning strategier25,35. In utero elektroporation kan vara vinklad mot i stamfäder genom att använda cell typ specifika initiativtagare och genom att placera elektroderna mot ventromediala strukturer, däribland den MGE36. Dessutom i livmodern elektroporation tillåter av tid uttryck för experimentell konstruktioner inom 1-2 dagar, jämfört med de 7-10 dagar som krävs för att konstruera uttryck använda virala vektorer25. Dock tenderar i livmodern elektroporation av i föräldraparets att vara låg avkastning. Faktiskt, även om pyramidal cell föräldraparets ligger i dorsala ventrikulära zonen kan vara effektivt transfekterade använder Utero elektroporation, inriktning mer ventralt ligger strukturer, såsom MGE, är mer tekniskt utmanande, särskilt i små e13.5 minskar embryon, och den höga andelen embryonal dödlighet ytterligare de experimentella avkastning25.
MGE explant experiment och i vivo i livmodern elektroporation för att kringgå några tekniska begränsningar associerade med in vitro , ex vivo organotypic skiva kulturer har varit utvecklade8,37, 38,39. Hjärnan organotypic skiva kulturer erbjuder fördelen att härma i vivo villkor, samtidigt som de mindre dyra och tidskrävande än genererar djur modeller25. Ja, dessa preparat ge en enkel åtkomst till MGE, tillsammans med de specifika visualiseringen av INs, och kan kombineras med fokal elektroporation att undersöka specifika molekylära vägar i INs migrerar i en mer fysiologisk miljö8 , 39 , 40 , 41. vi har därför optimerat en strategi för organotypic kulturer38som vi kombinerat med ex utero elektroporation och time-lapse confocal imaging, att ytterligare bedöma den morfologiska och dynamisk process som inträffar under tangentiella migreringen av MGE-INs. Detta protokoll var anpassad och optimerad från andra som har använt ex utero eller i livmodern hjärnan elektroporation och organotypic skiva kulturer för att studera migration av pyramidala celler42,43 och kortikala INs36,39,44. Specifikt, musembryon är halshuggas och MGE är electroporated ex vivo efter intraventrikulär injektion av de experimentella plasmidsna, vilket ger mer effektiv och exakt inriktning av MGE föräldraparets än vad som kan uppnås med i livmodern elektroporation. Hjärnor extraheras sedan och sektioneras i hela hjärnan koronalt skivor som kan vara odlade i några dagar, vilket möjliggör kontinuerlig spårning och avbildning av transfekterade INs. Detta tillvägagångssätt etiketter normalt 5-20 tangentiellt migrerar INs per hjärnan slice, minimera antalet experimentella iterationer som krävs för att nå statistisk signifikans, medan märkning en tillräckligt gles neuronala befolkning för att säkerställa enkel separation av enskilda nervceller för återuppbyggnad och fina morfologisk bedömning. Dessutom jämfört MGE bladsticklingar, organotypic kulturer säkerställa att migrera INs utsätts för en mer naturlig miljö, inklusive lokalt utsöndrade chemokiner och ingångar från thalamic afferenter. Detta tillvägagångssätt är alltså väl lämpade att kvantifiera riktverkan och flyttvägen antogs av transfekterade INs, samtidigt som den erbjuder tillräcklig anatomiska detaljer att tillåta karakterisering av finare dynamiska processer såsom ledande processen förgrening, nucleokinesis och efterföljande processen upprullning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med djur godkändes av Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) på CHU Sainte-Justine Research Center och genomfördes i enlighet med kanadensisk rådet på Animal Care's guide till Skötsel och användning av försöksdjur (Ed. 2).
Protokollet beskrivs här var optimerad för elektroporation embryon på embryonala dag (e) 13,5, vid en tidpunkt när MGE-derived INs är aktivt genereras, innan den topp av CGE-derived INs produktion45,46. Dessutom för att förflytta elektroporation mot GABAergic INs, använder vi en promotor selektivt uttryckt i INs (till exempel Dlx5/6 arrangören med dess minimala enhancer)47.
1. beredning av lösningar för elektroporation och Organotypic skiva kulturer
- Bereda 125 mL steril odlingsmedium.
- Mäta 125 mL av regelbundna neuron-specifika odlingsmedium (se Tabell av material för formulering) i en steriliserad flaska i en tidigare UV-steriliseras biosäkerhet skåp besprutas med 70% etanol. Lägg till 2,25 mL 50 x serumfritt neuron-specifika tillägg, 1.75 mL 200mM glutamin (slutliga koncentration av 0,5 mM) och 6,25 mL Värmeinaktiverade häst serum tidigare aliquoted under sterila förhållanden. Blanda väl, delprov i 15 mL steril koniska rör och förvaras vid 4 ° C.
Obs: Beredda odlingsmedium kan lagras i upp till 3 veckor vid 4 ° C. - Dela en 100 X stamlösning av Botteinsteins n-2 formulering48 i 150 µL portioner under sterila förhållanden och frysa vid-20 ° C fram till användning.
- Mäta 125 mL av regelbundna neuron-specifika odlingsmedium (se Tabell av material för formulering) i en steriliserad flaska i en tidigare UV-steriliseras biosäkerhet skåp besprutas med 70% etanol. Lägg till 2,25 mL 50 x serumfritt neuron-specifika tillägg, 1.75 mL 200mM glutamin (slutliga koncentration av 0,5 mM) och 6,25 mL Värmeinaktiverade häst serum tidigare aliquoted under sterila förhållanden. Blanda väl, delprov i 15 mL steril koniska rör och förvaras vid 4 ° C.
- Laga 1 L av sterila konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF).
- Mått 800 mL destillerat vatten i en 1-litersbägare. Tillsätt 25,67 g sackaros, 5,08 g natriumklorid (NaCl), 2,18 g natriumbikarbonat (NaHCO3), 1,80 g glukos, 0,19 g kaliumklorid (KCl), 0,15 g monobasiskt vattenfri natriumfosfat (NaH2PO4), 1 mL 1 M lager CaCl2 .2H2O och 2 mL 1 m lagerför MgSO4.7H2O. uppståndelse att upplösa vid rumstemperatur. Tillsätt destillerat vatten för att nå en total volym av 1 L.
- Använder ett 0,22 µm filter Filtrera lösningen i en steril flaska i en steriliserad biosäkerhet skåp och förvaras vid 4 ° C i upp till 1 månad.
- Förbered en ny lösning av 4% agaros i ACSF innan varje experiment.
- Mäta 25 mL tidigare beredda ACSF i en 50 mL sterilt koniska rör och tillsätt 1 g låg-smältande punkt agaros.
- Värme för 45 s i en mikrovågsugn. För att undvika spill, avbryta uppvärmning varje 3-4 s när kokningen börjar, öppna tuben för att låta trycket ut, stänga den igen och agitera manuellt för att blanda Agarens. Upprepa tills agar lösningen är homogen. Förvara agaros lösningen vid 42 ° C under återstoden av experimentet att undvika stelning.
Obs: Högre temperaturer skadar hjärnans vävnader.
2. förberedelse av plasmider för injektion
- Dra en glas Mikroskop pipett
- Ange den mikropipett avdragare med rätt parametrar, säkra glas kapillären i det angivna utrymmet och kontrollera att den är centrerad med glödtråden.
- Tryck på knappen dra.
- Ta försiktigt bort de nygjorda Mikroskop pipetterna från värme avdragare och plats i en låda eller ren petriskål tills vidare användning att undvika att skada spetsen.
- Set-up på biosäkerhet skåp med alla instrument behövs för detta experiment (se figur 1A), Spraya generöst alla instrument i biosäkerhet skåp med 70% etanol och sterilisera instrument och miljö med UV-ljus för 15-20 min.
- Under sterilisering steg, Tina plasmider på is (4 ° C).
- Mät 10 µL av en plasmid från en stamlösning (4 µg/µL) i en ren 1,5 mL centrifugrör. Lägg till 0,01% av snabb grön FCF. Blanda försiktigt, snurra kort och hålla på is fram till användning.
Obs: Maxi-prep DNA bör förberedas enligt tillverkarens protokollet använder en endotoxinfria maxi-prep-kit. DNA kan vara solubilized i TE buffert eller nuclease-fri H2O och beredning av Plasmiden med dye lösning kan, men behöver inte utföras under sterila förhållanden. Plasmider från Maxi-prep bör aliquoted att undvika flera frysning-tining cykler. Aliquoted plasmider ska blandas med färgen ingen mer att 2 h före användning och bör inte frysas för vidare användning. - Förbereda nano-injektorn som följer efter sterilisering.
- Välj ett av tidigare beredda glas Mikroskop pipetten förvaras i en ren låda eller petriskål och användning liten pincett att skära spetsen på pipetten på avfasade sätt att uppnå en yttre diameter på ungefär 15 µm.
Obs: Den yttre diametern som anges här är ett ungefärligt mått att ge användaren en uppfattning om vad vi använder i våra experiment och har optimerats för att underlätta piercing av skallen plasmid injektionsvätska utan att skada hjärnan, fördriva tiden tillåt för vätskan lastning och utsläpp av DNA. Yttre diameter kan mätas genom att titta på skär spetsen av glas Mikroskop pipetten apposed till en Mikrometerinställning skalstapeln i ljusa fält Mikroskop. - Använd en spruta för att fylla mikropipett med mineralolja från dess unpulled slut (att utvisa all luft).
- Infoga fyllda glas mikropipett i nano-injektorn genom att följa tillverkarens instruktioner.
- Tom 2/3rds av glas mikropipett (hålla tillräckligt med olja för att förhindra att luft).
- Välj ett av tidigare beredda glas Mikroskop pipetten förvaras i en ren låda eller petriskål och användning liten pincett att skära spetsen på pipetten på avfasade sätt att uppnå en yttre diameter på ungefär 15 µm.
- Noggrant sätt den förberedda mikropipett i röret som innehåller plasmiden/dye lösningen och fylla glas mikropipett med plasmid/dye lösningen.
3. insamling av musembryon från dräktiga honor
- Övervaka avelshonor dagligen för att bedöma för vaginal pluggning, helst vid samma tid varje dag (tidig eftermiddag). Dag e0.5 motsvarar den första dagen när en vaginal plug observeras.
Obs: De experiment som beskrivs här kan genomföras i vildtyps-möss. Men för att underlätta identifieringen av MGE och märka alla GABAergic INs (eller specifika sub uppsättningar såsom MGE-derived INs), transgena djur kan användas (t.ex.: GAD67andra; Dlx5/6Cre med en Cre-reporter allel, etc.47,49). I det här fallet bör experimentella plasmiden injiceras uttrycka en annan fluorophore (till exempel mCherry eller TdTomato) för att tillåta visualisering av de transfekterade INs (gul) som kan jämföras med icke-transfekterade INs (grön). - Offra kvinnligt på embryonala dag e13.5, av hals dislokation.
Obs: Bedövningsmedel som ges vid tidpunkten för offer kan påverka i migration och överlevnad50,51 och bör undvikas. - Samla in embryon av c-sektionen som följer.
- Spraya generöst kvinnliga buken med 70% etanol. Dra bukhuden upp med ett par steriliserad pincett och, med den andra handen, Använd steriliserad kirurgisk sax för att klippa huden från buken.
- Med ett par steriliserad pincett och sax, dra buken fascian upp och skär den samtidigt noga undvika livmodern.
- Använda ett tredje par steriliserad pincett och sax, dra uterin hornen och skära dem ur bäcken hålrummet. Placera de dissekerade livmoderns hornsna i en steril 60 mm petriskål fylld med neurala-baserade odlingsmedium som kompletteras med aminosyror, vitaminer och oorganiska salter (se Tabell av material för kommersiellt tillgänglig produkt).
- I en steril biosäkerhet skåp, använda två par fina pincett (en i varje hand) att dissekera embryona av moderkakan och isolera huvuden genom halshuggning.
- Fasning-cut spetsen av sterila 3 mL plast överföring pipett aspirera huvuden och överföra dem i en ny steril 60 mm petriskål skiktad med stelnad svart vax och fylld med samma neurala-baserade kompletteras odlingsmedium som ovan.
Obs: Detta steg minimerar överföring av föroreningar (mus hår, blod). Svart vax används för att stabilisera huvudet under dissektion. Kultur media behöver inte vara syresatt under dessa förfaranden.
4. intraventrikulär Plasmid injektioner och Ex Vivo elektroporation av MGE
Obs: Följande steg måste utföras under sterila förhållanden i den tidigare beredda biosäkerhet skåp.
- Plats 60 mm petriskål lager med svart vax och som innehåller de avhuggna huvuden i neurala-baserade kompletteras odlingsmedium under kikaren i biosäkerhet skåp.
- Stabilisera huvudet, rostralt delen åt höger, med fin pincett med vänster hand och använda nano-injektorn i höger hand för att injicera 1-2 µL av Plasmiden/dye lösningen i just laterala ventrikeln.
Obs: Samtidig uttryck experiment kan vara utförs av co-electroporating en rescue-plasmid och en shRNA-uttryckande plasmid genom att blanda båda plasmider vid equimolar koncentrationer. - Electroporate injiceras hjärnan.
- Placera huvudet mellan elektroderna med den negativa elektroden placerad dorsalt och parallellt med huvudet och den positiva elektroden mot den ventrala sidan av huvudet för att rikta MGE.
- När elektroderna är väl positionerat, leverera 4 fyrkantiga pulser av 40 V för 50 ms på 500 ms mellan puls intervall.
- Ta bort eventuella kvarvarande vävnad från elektroderna använder pincett redan placerats i biosäkerhet skåp.
Obs: Dessa parametrar har optimerats speciellt för de electroporator som används i våra experiment. Vi rekommenderar att användarna utför optimera tester i förväg om du använder en annan typ av electroporator. - Upprepa steg 4.1 till 4.3 för alla återstående hjärnor.
Obs: Även om det här protokollet beskriver de manipulationer som krävs för en hjärna, det är möjligt att injicera upp till 4 hjärnor sekventiellt innan electroporating varje hjärna, vilket ökar avkastningen. Denna strategi är särskilt fördelaktigt när 2 eller fler olika plasmider injiceras sekventiellt (t.ex. kontroll eller experimentella plasmid) under samma experiment (möjliggör jämförelse mellan kullsyskon). Dessutom är det möjligt att injicera och electroporate samtidigt båda sidor av hjärnan för att öka avkastningen, genom att placera elektroderna helt parallell med hjärnan ytan.
5. hjärnan dissektion och Organotypic skiva kulturer
- Medan fortfarande manipulera i sterila miljön av biosäkerhet skåp, dissekera hjärnan ur skallen.
- Stabilisera huvudet på lagret av svart vax genom att sätta en nål i varje öga samtidigt noga undvika hjärnan.
- Använd ett par fina pincett för att hålla vänster sida av halsen och ett par fina pincett att riva huden från skallen, från baksidan till framsidan.
- Medan du håller huvudet sidled med pincett i ena handen, Använd ett annat par pincett i andra handen försiktigt skära skallen på nivån av hjärnstammen och dra försiktigt skallen. Med varje pincett, skär skallen i sagittalplanet (mittlinjen) mot framsidan, och sedan incisionsfilm sidled för att befria kranium fragment.
- Lyft hjärnstammen och skär försiktigt i hjärnhinnor och kranialnerver tills hjärnan är helt ur skallen.
Obs: Alla stegen som beskrivs i 5.1 bör utföras under strikt sterila förhållanden i en biosäkerhet skåp.
- Bädda in hjärnan i 4% låg-smältande punkt agarosgelelektrofores för snittning.
- Fyll en 35 mm petriskål med agarosgelelektrofores lösning beredd enligt ovan (hålls flytande på 42 ° C).
- Snabbt överföra en electroporated hjärna i agaros-fyllda skålen med tidigare skurna transfer pipetten. Hålla skålen vid rumstemperatur.
- Rör om Agarens med en metall pinne att hålla hjärnan i mitten av brunnen (för att förhindra sjunka) och placera hjärnan i ett rostro-kaudala plan parallellt med skålen. Sluta omrörning när Agarens börjar stelna, för att undvika eventuella skador i hjärnan.
- Använd ett rakblad för att skära Agarens omger hjärnan för att bilda ett rektangulärt block, vilket lämnar en marginal på 1-2 millimeter runt hjärnan. Säkerställa att rostralt delen av hjärnan är vinkelrät mot den främre gränsen av blocket för att underlätta orienteringen för efterföljande snittningen steg.
- Upprepa för varje hjärna.
Obs: Det är möjligt att skära mer än en hjärna i taget (max 3) genom att forma separat agaros block tablåpaket varje hjärna på olika höjder.
- Vibratome koronalt avsnitt och slice kultur.
- Tina en alikvot av 100 X n-2 komplettera (150 µL) på is och lägga till 15 mL aliquoted odlingsmedium under sterila förhållanden.
- Över 750 µL av odlingsmedium (med 1 X N2 tillägg) till varje brunn 6-väl kultur platta.
- Med böjd pincett, placera en cell kultur Infoga (30 mm diameter, 0,4 µm porstorlek, PTFE) i varje medium-fylld brunn.
- Fyll vibratome badet med kontinuerligt syresatt ACSF. Kyla till 4 ° C med is kring badet, eller använda en kyld vibratome.
- Ange vibratome till 0,150 mm/s och frekvensen till 80 Hertz.
- Limma agaros blocket på vibratome plattform, rostralt kanten nedåt och ventrala kanten vetter mot användaren.
- Skär hjärnan i koronalt avsnitt att få 250 µm tjocka sektioner (vid 4 ° C).
- Med steriliserad spatlar, samla in 2-3 sektioner som innehåller MGE och plats alla hjärnan sektioner från ett djur på ett enda 30-mm membran Infoga, samtidigt noga undvika överlappning mellan sektioner. Placera in i ett väl 6-väl kultur platta (som innehåller 750 µL av kompletterade odlingsmedium, som beskrivs ovan). Alternativt kan varje avsnitt placeras på ett separat 13-mm diameter membran i en 12-väl kultur tallrik fylld med 500 µl kompletteras odlingsmedium. Mängden odlingsmedium som rekommenderas för varje brunn tillåter avsnitten hjärnan att få näring av media utan att vara nedsänkt.
Obs: Stegen som beskrivs i 5.3.6 och 5.3.7 inte utförs under komplett sterila förhållanden, om inte vibratome kan steriliseras och användas i en biosäkerhet skåp. Därför är det avgörande att genomföra dessa steg noggrant för att undvika kontaminering. Lämplig skyddsutrustning (ren mask, kirurgiska handskar och labbrock) ska bäras hela tiden och kroppsdelar, även täckt, såsom hår, ansikte och händer, bör aldrig passera över kultur plattor (med eller utan odlingsmedium). Det rekommenderas också att spraya 70% etanol ofta på handskar och spatlar brukade samla in avsnitten hjärnan. - Placera kultur plattan i en ventilerad sterila inkubator vid 37 ° C med 60% luftfuktighet och 5% CO2 för 48 eller 72 h.
Obs: Dessa inkubationstider var optimerad för time-lapse avbildning av MGE-derived INs och confocal avbildning av fasta skivor, respektive. Optimal inkubationstider ska testas i förväg för varje experimentell design. Dessutom, finns om valt ruvning är 72 h och under, det ingen anledning att ändra odlingssubstratet. För längre inkubationstider, bör odlingsmediet ändras varje 2-3 dagar. - Efter önskad inkubationstiden, överföra avsnitten av intresse till en 8-kamrar täckglas och tillsätt 3-5 µL av odlingsmedium. Plats på täckglas i en klimatkammare (37 ° C, 60% luftfuktighet, 5% CO2) anslutna till en inverterad spinning disk confocal utrustad med en datorstödd förvärv att ställa upp den time-lapse bildsession.
Obs: Alternativt sektioner kan vara fast med 4% PARAFORMALDEHYD (övernattning på 4 ° C eller 2 h i rumstemperatur) och därefter immunostained med olika antikroppar för visualisering av de morfologiska egenskaperna hos electroporated INs under en confocal Mikroskop. Även om andra och mCherry kan visualiseras genom konfokalmikroskopi utan någon kontra färgningsproceduren, rekommenderar vi utför immunhistokemi mot GFP och mCherry för att förbättra signalen eftersom processen fixering kan minska fluorescens, minska Påvisande av finare komponenter av embryonala nervceller, såsom mindre grenar i de inledande eller avslutande processerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta avsnitt tillhandahåller vi representativa resultat erhålls efter de ex utero elektroporation en kontrollplasmid eller en experimentell plasmid inriktning en gen av intresse, i MGE e13.5 mus embryon följt av organotypic skiva kulturer inkuberas vid 37 ° C för 48 h (för time-lapse imaging) eller 72 h (för fixering och immunhistokemisk märkning) (se figur 1B för Schematisk protokoll). Representativa exempel på INs migrera från en MGE explant är också illustrerad (se figur 1 c för Schematisk protocol) som en jämförelse till den metod som beskrivs här. Elektroporation av en plasmid i MGE föräldraparets verkar fördröja avfarten på INs från MGE och kulturtid måste justeras.
I ett lyckat experiment, organotypic skivor verkar friska under mikroskopet confocal, dvs kortikala skikt är lätt urskiljbara använder ljusa fält läge och det finns ingen synlig kontamination på skiva ytan (igenkännliga av intensiv autofluorescens och förekomsten av fluorescerande fibrer synlig under epifluorescence). I friska kronisk organotypic skivor genomgår ungefär 20% av cellerna apoptos efter 72 h i kultur (figur 2), som tidigare beskrivits i kronisk organotypic kulturer (e.g. postnatal kulturer)52. Ändå, brutto cytoarchitectural hjärnans struktur förblir väldefinierade, vilket illustreras här med DAPI färgning (figur 2A). Våra protokoll för ex vivo elektroporation av MGE ger ett genomsnitt på 50-100 transfekterade celler per segment (figur 3AB), av vilka 5-20 celler kommer att ses migrera dorsalt efter 72 h i kultur. Efter fixering och immunhistokemisk färgning, kan INs migrera tangentiellt mot kortikala plattan enkelt identifieras med konfokalmikroskopi som de presenterar en långsträckt/oval cellkroppen, enstaka avslutande processen och en ledande process orienterade tangentiellt. Den ledande processen vanligtvis ger upphov till en eller två grenar och igenkännlig genom närvaron av en tillfällig svullnad framför nucleus (bostäder i centrosome innan nucleokinesis) och tillväxt kottar i slutet av varje gren. (Figur 3 c-G).
Detta protokoll utformades för observationen av migrerar MGE-derived INs på enskild cell nivå med hjälp av time-lapse imaging. För detta särskilda experiment (figur 4) genererades koronalt organotypic hjärnan skivor från Dlx5/6Cre; RCEandra embryon electroporated på e13.5 med en plasmid som uttrycker en experimentell shRNA (inriktning en gen av intresse) och TdTomato kassett. Skivor var inkuberas i 48 h, överförs till en 8-väl kamrar täckglas maträtt (1 skiva per kammare flyter på ett tunt lager av kompletterade odlingsmedium) och avbildade var 3 minuter för 6-8 h med ett 20 x air (0.70 NA) mål på ett inverterat Mikroskop utrustat med en snurrande bricka confocal huvud, en datorstödd förvärv programvara och en stage-top miljökammare. Under imaging, skivor hölls vid 37 ° C och kontinuerligt syresatt och tilluften i miljömässiga kammaren (5% CO2 och 60% H2O). Electroporated MGE-derived INs var identifieras som sådan av deras uttryck för andra, bekräftar deras GABAergic i identitet och deras uttryck för TdTomato, bekräftar att de uttrycker experimentella plasmiden (figur 4AB). Electroporated INs är lätt identifierbara och väl isolerade, vilket kan ses i figur 4, möjliggör den finare analysen av migration dynamiska parametrar, såsom hastighet och avstånd reste. Dessutom märkt INs ses migrera tangentiellt mot kortikala plattan, medan i deras naturliga miljö, så att vi kan identifiera dynamiska morfologiska förändringar såsom förgrening av ledande processen och nucleokinesis (figur 4 c -F).
I ex vivo -elektroporation MGE-derived moduler kan också kombineras med MGE bladsticklingar aktivera högupplöst avbildning av dynamiska cytoskeletal processer som inträffar under migreringen, som ett komplement till studiet av riktverkan och flyttande dynamics organotypic kulturer. Som ett exempel, olika faser av neuronala locomotion påminner om de som förekommer under tangentiella migreringen av INs i organotypic segment kulturer kan observeras i electroporated INs migrera från en MGE explant 48 timmar efter elektroporation, såsom ledande neurite förlängning och nucleokinesis (figur 5B-E). Olika cytoskeletal processer kan sedan studeras med hög upplösning i isolerade celler migrerar från en MGE explant, till exempel genom färgning F-aktin strukturer med phalloidin (figur 6A), som inte kan uppnås optimalt i organotypic skivor med tanke på det höga cellulära densitet (och därmed av cytoskeletal element) i en miljö med infödda. Dessa cytoskeletal processer, och i synnerhet F-aktin remodeling, kan ytterligare studeras dynamiskt genom att kombinera Lifeact uttryck med time-lapse imaging. Exempelvis visar vi ett exempel på högupplösta time-lapse avbildning av en i härrör från en MGE explant erhålls från en Nkx2.1Cre; RCEandra mus hjärnan bär en riktade borttagning av en gen av intresse i moduler. Detta IN var transfekterade med mCherry-Lifeact-7 plasmiden under kontroll av promotorn CMV (gåva från Michael Davidson), metoden schematized i figur 1 c, möjliggör spårning av F-aktin ombyggnad som sker i realtid (figur 6b). således, medan organotypic kulturer krävs för att korrekt bedöma riktningen eller migration sökvägen till genetiskt modifierade INs, MGE bladsticklingar kan komplettera sådana studier genom att ge bättre tillgång till isolerade celler för högupplöst avbildning av dynamiska cytoskeletal processer.
Tekniska fallgropar kan resultera i ett misslyckande av de experiment som beskrivs ovan. Till exempel kan bädda in hjärnan i en agaros lösning varmare än 42 ° C resultera i vävnad förstörs och neuronala dödsfall, avslöjade av en förlust av genomskinlighet i hjärnan eller skivor, som blivit ogenomskinlig. Dock bör temperaturen inte hållas för låg, som en solidifying agaros lösning kan förstöra bräckliga embryonala hjärnan under processen inbäddning. För det andra kan kontaminering avsevärt minska avkastningen av de experimentella metoder som beskrivs här. Alla åtgärder bör således utföras med omsorg, under strikt sterila förhållanden så mycket som möjligt. Alla lösningar och utrustning ska steriliseras före användning och utrustning bör ofta besprutas med 70% etanol att undvika kontaminering från antingen bakterier eller mögel. Kontaminering kan synas direkt i kultur brunnar, som odlingssubstratet blir gula eller ogenomskinlig. Kontaminering kan gå obemärkt förbi när odlingssubstratet förblir klar och flytande. Men ett lager av mögel på skiva ytan kan vanligtvis observeras eller skivor blir alltför bräckligt under fixering och färgning steg. När sådana skivor visualiseras under mikroskopet, kontaminering kan manifesteras som ett lager av autofluorescens över märkt nervceller eller avslöjas av förekomsten av långa fluorescerande filament. Organotypic skivor förvaras i förorenade brunnar bör kastas, men skivor odlade i de andra brunnarna i samma plattan kan hållas för ytterligare åtgärder. Bakteriell kontaminering är ganska ovanligt men bör tas på allvar, vilket innebär att all utrustning, inklusive delade inkubatorer och kultur rum manuellt bör rengöras och steriliseras.
Figur 1: Schematisk representationer av protokollen för ex utero elektroporation följt av organotypic skiva kultur eller MGE explants. A. exempel på en biosäkerhet skåp installation med alla steriliserade instrument behövs för det protokoll som beskrivs här. B. schematisk representation av det protokoll som används för ex utero elektroporation och organotypic skiva kulturerna. Kort, embryon är halshuggas, experimentell plasmiden injiceras i laterala ventrikeln (1) och electroporated i MGE (2). Hjärnan är microdissected ur skallen (3) och inbäddade i agaros (4). Organotypic avsnitt genereras på en vibratome (5) och placeras i kultur på 37 °C(6) i 48 h för time-lapse mikroskopi (7.1) eller 72 h för cell rekonstruktioner (7,2). C. Schematisk framställning av protokollet anpassad från Myers et al. 201353 och används för generering av MGE explants. Kortfattat, dorsolaterala cortices är först dissekeras ut från e12.5 till e14.5 vildtyp musembryon (1) och separeras mekaniskt i kompletterade odlingsmedium (2). Kortikala celler är klädd med en täthet av 5,25 x 105 kortikala celler/cm2 och odlade för 2 h vid 37 ° C i ett kollagen/poly-L-lysin-coated 8-kamrar täckglas (3). Sedan, e13.5 Dlx5/6Cre; RCEandra embryon som bearbetas för ex utero elektroporation av MGE (4, 5), och MGE är manuellt isolerad från hjärnan och skära i 100 µm2 fragment (6). Dessa bladsticklingar placeras ovanpå tidigare beredda kortikala feeder lagret sedan, täckt med odlingsmedium och samtidig odlade för 48 h innan time-lapse imaging (7). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: bevarade cytoarchitecture i friska organotypic skivor. Generering av organotypic skiva kulturer efter ex vivo elektroporation av Nkx2.1Cre; RCEandra musembryon (A) inte leder till betydande vävnadsskada, som avslöjades av bevarade cytoarchitecture (DAPI (blå) och Cre-reporter (GFP)), jämfört med en 18 µm tjocka cryosection från en Nkx2.1Cre; RCEandra embryo transcardially perfusion med 4% PFA på e15.5. D och M anger dorso-ventrala och latero-mediala yxor, respektive. (B). hög förstoring bilder tagna med en inverterad confocal Mikroskop utrustade med en 63 x / 1.4 olja mål efter färgning med en anti-avspjälkar-kaspas 3 antikropp (Cl-cas3) avslöja att ungefär 20% av cellerna i kortikala plattan genomgår apoptos (vit pilspetsar) efter 72 h i kultur, medan GFP-positiv INs vistelse friska (vit pil), som exemplifieras i mikrofotografier i C-C'' '. I jämförelse, cellulära apoptos är nästan helt frånvarande från den tunna cryosection från ett perfunderade djur (D-D'' '). Skala barer: 250 µm (A-B) och 15 µm (C-D'' '). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Organotypic skivor av möss hjärnan embryon och hög förstoring mikrofotografier av electroporated interneuroner (INs). A. en organotypic skiva kultur från en Dlx5/6Cre; RCEandra mus hjärnan (där alla moduler är gröna) electroporated med en Dlx5/6::shRNAäggröra-IRES-TdTomato plasmid. Segmentet var fast med 4% PFA efter 72 h i kultur och immunostained för god Jordbrukarsed och mCherry. Electroporated INs var avbildade i 3D (50-60 µm tjocka z-stackar med optisk sektioner tagit varje 0,5 µm) med confocal Mikroskop utrustade med en 63 x / 1.3 NA olja mål. INs migrera tangentiellt i sub ventrikulära zonplanerar av dorsala palliet är lättidentifierade (röd, öppen pil). D och M anger dorso-ventrala och latero-mediala yxor, respektive. B. en representativ organotypic skiva kultur från en vildtyp (WT) embryo electoporated med en kontroll Dlx5/6::shRNAäggröra-IRES-TdTomato plasmid, fast på 72 h och immunostained för mCherry endast. Electroporated INs (röd) ses migrera dorsalt mot kortikala plattan. Electroporated INs identifieras av deras samtidig uttryck för TdTomato och andra i Dlx5/6Cre; RCEandra möss (C-D), eller genom deras uttryck för TdTomato endast i WT möss (E-H), och deras typiska morfologi, dvs en oval cell kropp, en förgrenad ledande process (vit pilspetsar, D-H), en enstaka avslutande processen (vit pil, C-D) och en tillfällig svullnad av ledande processen bostäder i centrosome innan nucleokinesis (vit stjärna i C-C' och G). Skala barer: 250 µm (A-B) och 25 µm (C-H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Time-lapse live-avbildning av electroporated INs i organotypic skivor odlade för 48 h. INs electroporated på e13.5 med en experimentell plasmid uttrycker TdTomato kassett och en shRNA inriktning en gen av intresse ses i tangentiell migration i ett organotypic hjärnan segment från en Dlx5/6Cre; RCEandra mus embryo efter 48 h av kultur (A, vit kvadrat). I B, den samma electroporated i (vit kvadrat) ses i färd med att nucleokinesis, medan migrera tangentiellt i cortex, dvs parallellt till pial ytan, och följs i time-lapse imaging var 3 minuter för 8 h med en 20 x / 0,85 NA luft mål (utvidgade lådor, C-F). Neuron visar initialt en långsträckt cell kropp (öppen pil) håller på att nucleokinesis (C), samt en efterföljande process (vit pil) och en förgrenad ledande process (vit pilspetsar). Efter 3 h för live-imaging, nucleokinesis är klar, den efterföljande processen har indragen och ledande processen är att utvidga två långa grenar (D, vit pilspetsar). Efter 5 h 30 min, en av de ledande process grenen har indragen (vit pilspetsar) och neuron cellkroppen (öppen pil) har flyttat framåt ca 10 µm (E). Slutligen, efter 8 h Imaging, migration har pausats, neuron har förlängt sin ledande process igen och en efterföljande process har medverkat (vit pil), men kärnan (öppen pil) har ännu inte flyttat framåt (F). Skala barer: 250 µm (A), 70 µm (B) och 30 µm (C-F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Time-lapse avbildning av INs härrör från en MGE explant odlade för 48 h. INs ses migrerar ut ur en MGE explant erhålls från en Nkx2.1Cre; RCEandra mus (i vilken alla MGE-derived INs express andra) electroporated med CMV::mCherry-LifeAct-7 plasmiden på e13.5, metoden anpassas från Myers et al. 201353 och schematized i figur 1 c, och odlade för 48 h (A). INs var visualiserat med time-lapse live-imaging för 5 h (B-E). I det här exemplet en samtidig uttrycker andra och LifeAct ses initialt i färd med att nucleokinesis (öppen pil) och sträcker sig två ledande process grenar (vit pilspetsar; B). detta i Slutför nucleokinesis efter 1 h (se öppen pil), som cellkroppen har gått framåt och en efterföljande process har dykt upp på baksidan av cellkroppen (vit pil), och fortfarande visar en ledande process med två grenar (vit pilspetsar; C). en andra nucleokinesis pågår efter 2 h 30 min (öppen pilar) och IN nu är begåvad med två ledande processer med ursprung från cellkroppen och en längre avslutande process (vit pil; D). Slutligen efter 5 h, IN dras en neurite medan translocating centrosome i återstående ledande process grenen (vit pil) som förberedelse för en tredje nucleokinesis, med en efterföljande process (vit pil) kvar på baksidan av cellkroppen (E). Skala barer: 70 µm (A) och 20 µm (B-E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: högupplösta time-lapse imaging av aktin remodeling i moduler från en MGE explant odlade för 48 h. A. En organotypic skiva från en Nkx2.1Cre; RCEandra mus hjärnan är fast på e15.5, målat med Alexa-594 Phalloidin, möjliggör visualisering av fintrådiga aktin. INs är avbildad med en 63 x / 1.3 NA olja mål på en confocal Mikroskop. I friska INs, fintrådiga aktin ses koppning baksidan av cell kroppen efter indragning av den efterföljande processen efter avslutning av nucleokinesis (vit pil, A'-A'' '). B. en MGE explant erhålls som ovan från en Nkx2.1Cre; RCEandra mus hjärnan bär en riktade borttagning av en gen av intresse och electroporated med en plasmid som uttrycker mCherry-Lifeact-7 under kontroll av promotorn CMV . Time-lapse levande imaging utförs efter 48 h av kultur och electroporated INs följs var 3 minuter för 3 h med en 40 x / 0,85 luft mål. Aktiva omdaning av aktin cytoskelettet uppstår i DENI transfekterade med LifeAct, som exemplifieras av rörelsen av röd (vit i de svartvita bilderna) fluorescerande prickar inom de ledande process och tillväxt kottarna (vit pilspetsar) och på baksidan av den cellkroppen under nucleokinesis (B-B'' ', vita pilar). Skala barer: 7 µm (A-A'' ') och 10 µm (B-B'' '). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln ger vi en pålitlig metod för att utföra ex utero elektroporation musen MGE på e13.5 och för generering av organotypic kulturer av embryonala hjärnan skivor. Även om in vitro- metoder, såsom Boyden kammare analysen, är relativt enkla att utföra och kan användas för att bedöma de särskilda rollerna av olika gener och proteiner utan inblandning av andra faktorer, utesluter de utredning av IN migration dynamik när det gäller riktverkan och migration väg25. MGE bladsticklingar ger ett användbart medel för att studera de dynamiska cytoskeletal förändringar inträffar i migration, som vi visar här, men de saknar mest endogena cues och ofta kräver tillsats av vägledning ledtrådar att främja neuronal migration (även om detta är betydligt bättre när MGE bladsticklingar odlas på kortikal feeder lager)25,54. Dock kan analyser baserat på MGE bladsticklingar misslyckas att upptäcka innebörden av molekylära signaler inblandade i mer subtila mekanismer såsom de vägledande specifika riktverkan eller migration sökvägen till INs29. Detta problem var så småningom kringgås av Utero elektroporation25, vilket möjliggör specifik märkning av MGE-derived INs migrerar i deras infödda miljö13,29,41. Men denna teknik är skill-utmanande, på grund av de kirurgiska ingrepp som är inblandade, och dess avkastning begränsas av låga överlevnaden av embryon och det faktum att MGE är svårt att rikta in i livmodern, ofta kräver användning av flera kullar till nå betydelsen55. Därav, ex utero elektroporation av den MGE följt av organotypic kultur av möss hjärnan embryon ger en låg kostnad, tid-effektiv och tillförlitlig metod för att undersöka migration dynamiken och morfologi av MGE-derived INs i deras naturliga miljö, medan kringgå de kirurgiska ingrepp i livmodern elektroporation och behovet av vägledning ledtrådar i MGE bladsticklingar. Denna teknik tillåter dessutom en lättare tillgång till de MGE, som kan riktas av direkt mn den positiva elektroden under halsen och den negativa på toppen av huvudet, en konfiguration som är svårare att anta i livmodern. Alternativt, MGE kan injiceras focally och electroporated direkt efter generera organotypic skivor13,25,29, men denna teknik har visat sig svårare och mindre effektivt i våra händer än det protokoll som beskrivs här. Genom att följa stegen som beskrivs i denna artikel, kommer man få 50-100 electroporated MGE-derived INs per organotypic skiva, 5-20 som kommer att ses migrera tangentiellt ur MGE efter 72 h. Transfected INs kan visualiseras live med time-lapse imaging eller avbildad och rekonstruerade efter fixering och immunhistokemisk märkning.
Protokollet beskrivs här var optimerad för att studera i migration ex vivo och inspirerades av olika publicerade protokoll som beskriver Utero elektroporation MGE-derived INs, ex vivo MGE injektion och elektroporation, eller generering av kronisk organotypic hjärnan slice kulturer36,38,39,42,43,56,57,58. Vårt synsätt begränsar potentiell skada på MGE föräldraparets med lägre puls intensitet (40 V) och intraventrikulär plasmid injektioner i stället för intra MGE injektioner med högspänning pulser (100 V), som beskrivs på andra ställen39,56 ,57,58. Vidare, medan andra använder en kombination av penicillin, streptomycin och gentamycin för att förhindra bakteriell kontamination39,56,57,58, vi har valt för att undvika antibiotika i vår kultur medium eftersom de kan teoretiskt påverka migrationen. I synnerhet penicillin är en antagonist av GABAA receptor59,60, och GABAA receptor aktiveringen aktiveras och senare slutar i migration beroende på intracellulära klorid övertoningar och KCC2 uttryck på olika faser i migration61. Dock kan använder de olika försiktighetsåtgärder som anges i det nuvarande protokollet, förorening effektivt undvikas även i frånvaro av antibiotika.
Trots effektiviteten av detta tillvägagångssätt i våra händer har ex utero elektroporation också sina nackdelar. Medan som ger en naturligt tredimensionell miljö för celler för att migrera, kan det vara svårt att utföra farmakologiska analyser i organotypic skivor i samband med migration. Verkligen, migration av MGE-derived INs beror mest på extracellulära signaler2,13,19 och tillämpningen av farmakologiska hämmare eller aktivatorer på organotypic skivor tillåter inte exakt dissociation av cell autonoma effekterna från globala effekter på hälsa slice eller aktivitet. För sådana experiment vara MGE bladsticklingar vuxit över blandade dissocierade kortikala celler att föredra att organotypic skiva kulturer, eftersom INs migrerar ut ur explant kan lättare isolerad och utsatt selektivt för specifika föreningar62. Dessutom även om ex utero elektroporation är enklare att utföra än i livmodern elektroporation, kan det fortfarande vara tekniskt utmanande på embryonala tiderna illustreras här med tanke på den ringa storleken och sköra tillstånd av embryonala brains på E13.5. utredare behöver några prövningar effektivt extrahera electroporated hjärnor på e13.5 utan att skada hjärnan ytan. Dessutom, i motsats till postnatal skivor, får inte embryonala organotypic skivor hållas i kultur under långa tidsperioder. Även om embryonala organotypic skiva kulturer kan förvaras i minst 7 dagar i vitro63, detta kombinerades inte med elektroporation och de experiment som beskrivs här har testats för upp till 3 dagar i vitro med tillförlitliga resultat i våra händer. Därför bör utredare utföra optimering tester i förväg om längre inkubationstider behövs. Vidare utredning av i utveckling vid sena embryonala eller tidig postnatal stadier rekommenderas inte med denna teknik när du använder e13.5 embryon25, men kan uppnås med Utero elektroporation, där framgångsrikt electroporated embryon sätts tillbaka i livmoderhålan och kan stå för att vara född och analyseras på senare stadier21,64. Slutligen, ex utero elektroporation följt av organotypic skiva kulturer möjliggör analys av både morfologi och migration dynamiken i utvecklingsländer INs. Men som det har varit tidigare påpekat för den i livmodern elektroporation teknik36, ex utero electroporations ge 50-100 electoporated celler per hjärnan slice och är därmed inte lämpliga för analys av populationen. Sådana utredningar genomförs bättre i djurmodeller som bär antingen full eller villkorlig borttagning (eller inpressning) av genen av intresse. När tillgängliga, sådana modeller kan effektivt användas för att generera organotypic skiva kulturer eller MGE explants för att visualisera faktiska dynamik i migration, som visat här (se figur 5 och figur 6).
Många steg i detta protokoll bör utföras noggrant för att erhålla optimala resultat. Det är exempelvis primordial att alla steg utförs under strikt sterila förhållanden som kontaminering kan inträffa helt enkelt. Handskar och instrument som används utanför biosäkerhet skåp skall sprutas med 70% etanol frekvent under hela förfarandet. Dessutom lösningar såsom kultur media och konstgjorda cerebrospinalvätskan bör hållas steril och kall (4 ° C), och gjort färska varje 2-3 veckor. Etikettera MGE-derived INs mer specifikt, plasmider som kommer att användas i sådana experiment ska klonas under kontroll av en IN-specifika promotorn (ex: Dlx5/649, Lhx665), istället för att bara förlita sig på den anatomiska inriktning av MGE. Generering av organotypic skivor kräver hjärnan för att överleva. Således, för att bevara cell hälsa och överlevnad, detta experiment bör utföras i mindre än 3 timmar från ögonblicket att embryon är Hämtad tills organotypic skivor läggs i kultur. För tid-effektivitet, kan kultur plattor förfylld med hemmagjord odlingsmedium precis innan experimentet och sätta i 37 ° C cell kultur inkubatorn fram till användning. Dessutom ska hjärnor vara noggrant dissekeras ur skallen utan skador till kortikala ytan för att uppnå korrekt inbäddning i agaros lösning och efterföljande vibratome-snittning. Exempelvis kan det orsaka skada på kortikala ytan, även minimal, i avskildheten av de 250 µm tjock avsnitten från den omgivande agarosgel eller nedbrytning av avsnitten under vibratome snittning. För neuronal överlevnad, är det också avgörande att agaros lösningen temperaturen förblir nära 42 ° C, eftersom högre temperaturer leder till skador och cell vävnadsdöd, medan lägre temperaturer kommer hinder för korrekt inbäddning av hjärnan (eller skada den under den inbäddning process). En gång i kulturen, för att undvika andra förorening källor, skivor bör inte manipuleras tills de överförs till mikroskopet för avbildning. Dessa steg bör utföras i en steriliserad miljö och uppmärksamhet måste ägnas inte förorena plattorna efter dessa manipulationer, särskilt om de behöver sättas tillbaka i kulturen för efterföljande ny avbildning. Slutligen rekommenderar vi inte återhämtade en DNA alikvot blandat med lastning färgämne från tidigare experiment för framtida användning som vi observerat en betydande minskning av avkastningen av electroporated nervceller med sådant material.
Sammanfattningsvis, ex utero elektroporation och organotypic skiva kultur protokollet beskrivs ovan möjliggör specifik märkning av MGE-derived INs på enskild cell nivå och kan användas för att genetiskt manipulera specifika molekylära vägar till studera deras roll i reglering av morfologiska förändringar och migration dynamiken i tangentiellt migrerar INs. Denna metod möjliggör snabb och billig tidiga funktionella undersökningen av romanen kandidatgener som identifieras genom enstaka cell RNA-sekvensering av flyttande INs66,67 eller nästa generations sekvensering av patienter med nervsystemets sjukdomar68,69,70. Denna teknik har använts i stor utsträckning att studera migration i andra cellpopulationer, inklusive pyramidala celler i hjärnbarken och hippocampus70,71,72,73. När behärskar, skulle det potentiellt kunna användas till bild återvinning och handel av membranproteiner, såsom receptorer och kanaler med GFP-märkta proteiner; aktivering av specifika cellulär signalering kaskad använda biosensorer74; eller ens övervakning och manipulation av cellulär aktivitet med hjälp av kalcium imaging kopplat till optogenetik i kortikala INs, men också i andra områden i hjärnan, såsom hippocampus, amygdala eller ens striatum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja. De åsikter som uttrycks här representerar inte nödvändigtvis åsikter hälsoministern eller Kanada.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av administrationsbidrag från Savoy stiftelsen och stiftelsen bota epilepsi och utrustning ger från den kanadensiska fonden för Innovation att Ekman (confocal Mikroskop) och motiv (snurrande bricka confocal Mikroskop). E.R. mottar en karriär award från den Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) as well as från kanadensiska instituten för hälsoforskning (CIHR; Unga Investigator Award). G.H. är en ledande vetenskapsman av FRQ-S. Larsson är mottagare av utmärkelsen Steriade-Savoy postdoktorala utbildning från stiftelsen Savoy, utmärkelsen CHU Sainte-Justine Foundation postdoktorala utbildning och FRQ-S postdoktorala utbildning award, i samarbete med stiftelsen av stjärnorna. Projektet har möjliggjorts genom hjärnan Kanada genom Kanada hjärnan forskningsfonden, med finansiellt stöd av Health Canada, tilldelas L.E.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html |
| B-27 serum-free supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | 50X Serum-free neuron specific supplement |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11415064 | Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Horse serum, heat inactivated | Millipore-Sigma | H1138-500ML | |
| Neurocell supplement N-2 100X | Wisent | 305-016 | Botteinstein's N-2 Formulation |
| VWR Square PETG Media Bottles 125 mL | VWR | 89132-062 | |
| Class II Type A Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-540 | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.1 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.1 | |
| Sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| D+ glucose | Millipore-Sigma | G7528-250G | |
| Potassium Chloride | ThermoFisher Scientific | P217-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | BioShop | SPM400.500 | |
| Calcium chloride dihydrate | ThermoFisher Scientific | C79-500 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | BiosShop | MAG522 | |
| Agarose | BioShop | AGA002.500 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Model P-97 | |
| 0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube | Drummond scientific | 1-000-800/12 | |
| Ethanol | VWR | E193 | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson & Co | 309646 | |
| Mineral Oil (heavy) | Rougier Pharma | ||
| WPI Swiss Tweezers #5 | World Precision Instruments | 504511 | 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these. |
| WPI Swiss Tweezers #7 | World Precision Instruments | 504504 | 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips |
| HTC Tweezers | World Precision Instruments | 504617 | 11 cm, Straight, flat |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501225 | 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these. |
| Dressing Forceps | World Precision Instruments | 501217 | 12.5 cm, straight, serrated |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 504478 | 10.2 cm, full curve, serrated |
| DeBakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501996 | 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide |
| Fisherbran Microspatula with rounded ends | FisherScientific | 21-401-5 | You will need 2 of these. |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond scientific | 3-000-204 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | 60-mm dish |
| Tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800 | 35-mm dish |
| Black Wax | FisherScientific | S17432 | |
| Transfer pipettes | Ultident | 170-CTB700-212 | 3 mL, small bulb |
| Stereo Microscope | Leica Biosystems | Leica M80 | In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific) |
| Electro Square Porator | BTX Harvard Apparatus | ECM 830 | |
| Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | |
| 25G 1 1/2 | Becton Dickinson & Co | 305127 | |
| Leica VT1000S Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| GEM, Single edge razor blade | Electron Microscopy Sciences | 71952-10 | Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome |
| µ-Slide 8 well | Ibidi | 80827 | Pack of 15 |
| Millicell cell culture insert | Millipore-Sigma | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. |
| Leica DMi6000 microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Spinning disk confocal head Ultraview Vox | Perkin Elmer | N/A | |
| Volocity 6.0 acquisition software | Improvision/Perkin Elmer | N/A | |
| LiveCell Stage top incubation system | Pathology devices | LC30030 | Provides Temperature, CO2 and humidity control. |
| SP8 confocal microscope | Leica | ||
| mCherry-Lifeact-7 | Addgene | 54491 | Gift from Michael Davidson |
| Fast Green FCF | Millipore-Sigma | F7258-25G | 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission |
References
- Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. , 649325 (2011).
- Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562 (Pt 1), 9-26 (2005).
- Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71 (1), 45-61 (2011).
- Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38 (1), 2019-2029 (2013).
- Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44 (2), 251-261 (2004).
- Zhu, Y., Li, H. -S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
- Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28 (1), 62-73 (2008).
- Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59 (5), 733-745 (2008).
- Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69 (4), 763-779 (2011).
- Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30 (20), 7072-7077 (2010).
- Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25 (24), 5691-5699 (2005).
- Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H.
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30 (25), 8660-8670 (2010).
- Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. , (2017).
- Chu, J., Anderson, S. A.
- Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23 (4), 894-900 (2006).
- Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2 (2), e00031 (2010).
- Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63 (4), 466-481 (2009).
- Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120 (4), 503-535 (2010).
- McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165 (3), 775-784 (2004).
- Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109 (4), 400-404 (2005).
- Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7 (5), (2017).
- Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25 (15), 1221-1226 (2014).
- Zito, A., et al.
- Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25 (4), 991-1003 (2015).
- van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77 (1), 70-82 (2013).
- Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
- Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22 (3), 680-692 (2012).
- Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34 (14), 4941-4962 (2014).
- Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26 (10), 1131-1148 (2016).
- Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15 (3), S371-372 373-380 (2012).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
- Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97 (2), 287-292 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32 (2), 738-745 (2012).
- Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27 (14), 3875-3883 (2007).
- Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524 (2014).
- Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
- Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, 2.26.21-22.26.18 (2016).
- Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
- Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59 (5), 722-732 (2008).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
- Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20 (2), (2000).
- Bottenstein, J. E. Cell culture in the neurosciences. , Plenum Press. (1985).
- Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30 (15), 5334-5345 (2010).
- Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118 (3), 516-526 (2013).
- Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865 (2016).
- Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92 (12), 1785-1791 (2014).
- Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34 (23), 7787-7801 (2014).
- Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28 (7), 1613-1624 (2008).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32 (49), 17690-17705 (2012).
- Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19 (1), 27-37 (1997).
- Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129 (1), 245-252 (2002).
- Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23 (4), 729-744 (2012).
- Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
- Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496 (1-3), 23-32 (2004).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62 (1), 53-71 (2009).
- Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15 (2), 229-237 (2016).
- Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex--an in vitro study. Neuroscience. 201, 357-365 (2012).
- Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7 (1), 4897 (2017).
- Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27 (12), 3078-3089 (2007).
- Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93 (5), e1035 1035-1048 (2017).
- Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656 (2017).
- Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23 (18), 4846-4858 (2014).
- Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501 (7466), 217-221 (2013).
- Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
- Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33 (21), 9122-9139 (2013).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
- Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
- Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).
