Trattamento intracerebroventricolare con Resiniferatoxin e test del dolore nei topi
Summary
Il potenziale vanilloide di tipo 1 (TRPV1) nella regione sovraspinale è stato suggerito di svolgere alcuni ruoli nella funzione cerebrale. Descritto qui è un protocollo per l’iniezione intracerebroventricolare di resiniferatoxin per la desecizione trPV1 sovraspinale nei topi. Vengono inoltre presentate le procedure per alcuni esami del dolore.
Abstract
Il recettore transitorio potenziale vanilloide di tipo 1 (TRPV1), un canale termosensibile, è noto per innescare dolore nei nervi periferici. Oltre alla sua funzione periferica, è stato suggerito anche il suo coinvolgimento nelle funzioni cerebrali. Resiniferatoxin (RTX), un agonista TRPV1 ultrapotente, è stato conosciuto per indurre la dese riesensibilità a lungo termine di TRPV1, e questa desesensibilità è stato un approccio alternativo per studiare la rilevanza fisiologica delle cellule che esprimono TRPV1. Qui descriviamo un protocollo per il trattamento intracerebroventricolare (i.c.v.) con RTX nei topi. Le procedure sono descritte per il test della stimolazione TRPV1 periferica (test RTX) e la stimolazione meccanica (test di pressione della coda) quindi seguire. Anche se le risposte nocicettive dei topi che erano stati somministrati RTX i.c.v. erano paragonabili a quelle dei gruppi di controllo, i topi somministrati da RTX-i.c.v. erano insensibili all’effetto analgesico dell’acetaminofene, suggerendo che il trattamento i.c.v. RTX può indurre la desensitizzazione trPV1 sovraspinal-selettiva. Questo modello murino può essere utilizzato come un comodo sistema sperimentale per studiare il ruolo di TRPV1 nella funzione cerebrale/sovraspinale. Queste tecniche possono anche essere applicate agli studi sulle azioni centrali di altri farmaci.
Introduction
Gli animali ricevono vari stimoli fisici e chimici dal loro ambiente attraverso sensori sui nervi periferici. Il recettore transitorio potenziale vanilloide di tipo 1 (TRPV1) è uno dei canali termosensibili, non selezionativi che agiscono come sensori di calore1,2e l’attivazione e/o modulazione di TRPV1 è noto per essere un passo chiave per la nociception in entrambi i contesti normali e infiammatori3. Anche se il modello di espressione generale è controverso, l’espressione di TRPV1 è stata suggerita anche nelle regioni sovraspinali, essendo coinvolta in varie attività cerebrali (tra cui nocezione4, termoregolazione5,ansia 6, disordine di iperattività di deficitdi attenzione 7e epilessia8). Inoltre, è stato recentemente suggerito che l’acetaminofene, un antidolorifico ampiamente usato, media l’attivazione del TRPV1 centrale per suscitare la sua azione analgesica9,10.
La somministrazione di agonisti TRPV1 in eccesso, tra cui capsaicina e resiniferatoxin (RTX) agli animali porta alla morte di neuroni TRPV1-positivi e desecizione di lunga durata a TRPV1 agonisti11,12. In combinazione con l’applicazione locale (intrathecal13,14, intracisternale15,16,17e intraganglional18), questo approccio di ablazione chimica ha fornito un modo alternativo per indagare le funzioni fisiologiche di TRPV1. Recentemente abbiamo riferito che l’iniezione intracerebroventricolare (i.c.v.) di RTX inibisce l’effetto analgesico dell’acetaminofene nei topi, suggerendo la desegnibilità TRPV1 sovraspinale-selettiva19. In questo manoscritto, presentiamo il protocollo preciso per l’iniezione i.c.v. e i successivi test del dolore.
L’iniezione diretta di farmaci nei ventricoli del cervello permette di studiare i loro effetti centrali, minimizzando eventuali effetti periferici. La procedura di iniezione i.c.v. presentata qui è una modifica del metodo riportato da Haley e McCormick20. Questo metodo è semplice che comporta l’inserimento di un ago di iniezione nei ventricoli successivi attraverso la sutura coronale e non richiede alcuna attrezzatura speciale o procedure chirurgiche per la cannulation.
L’applicazione locale periferica degli agonisti TRPV1 evoca una sensazione di dolore bruciante e infiammazione neurogenica. I topi trattati sistemicamente con RTX e topi TRPV1-KO sono insensibili a questa stimolazione13. Abbiamo eseguito l’iniezione intraplantar di RTX (test RTX) per confermare la conservazione della periferica TRPV1 in RTX-i.c.v. Topi. Questo metodo è una modifica del test formalina convenzionale21.
È stato riferito che i topi trattati sistemicamente con topi RTX e TRPV1-KO mostrano una soglia normale agli stimoli meccanici11,13,22. Qui presentiamo una procedura per il test di pressione della coda per testare i cambiamenti nell’effetto analgesico dell’acetaminofene.
Tutte queste procedure sono ortodosse e versatili, e possono essere applicate agli studi di altri farmaci.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il passo più critico in questi esperimenti è il successo dell’iniezione i.c.v. La tecnica di iniezione i.c.v. utilizzata qui è abbastanza semplice, ma richiede una certa pratica. Prima degli esperimenti, si raccomanda la pratica con coloranti (ad es. 0,5% di blu di prova in salina). Se l’iniezione viene eseguita correttamente, un segno di ago deve essere evidente sulla sutura coronale e il colorante iniettato deve essere presente nel ventricolo contralaterale e nel terzo ventricolo. Inoltre, l’inserimento forzato deve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| Resiniferatoxin | LKT Laboratories | R1774 | used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test |
| Acetaminophen | IWAKI SEIYAKU | gifted from IWAKI SEIYAKU | |
| Pentobarbital sodium salt | Tokyo Chemical Industry | P0776 | used for anesthesia |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemical Industries | 057-00456 | used for dissolving RTX |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate | Wako Pure Chemical Industries | 161-21621 | used for dissolving RTX |
| 25 mL microsyringe | Hamilton | 1702LT | used for i.c.v. injection |
| 100 mL microsyringe | Hamilton | 1710LT | used for intraplantar injection |
| 26-gauge disposable needle | TERUMO | NN-2613S | used for i.c.v. injection |
| 30-gauge disposable needle | NIPRO | 01134 | used for intraplantar injection |
| Pressure meter | Ugo Basile | Analgesy-Meter Type 7200 | used for tail pressure test |
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